Somministrazione intratecale di un composto di prova al sistema nervoso centrale del ratto

Abstract

Fonte: Chen, Y., et al. Somministrazione intratecale di oligonucleotidi antisenso nel sistema nervoso centrale del ratto. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra l'erogazione di un composto di prova nel liquido cerebrospinale (CSF) attraverso un catetere impiantato nella colonna vertebrale lombare di un modello di ratto. Il composto circola lungo il liquido cerebrospinale fino al cervello e al midollo spinale, entra nei neuroni e offre un potenziale terapeutico.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Chirurgia

1. Con il ratto supportato dal tubo conico da 50 mL, identificare le due fosse naturali tra i muscoli sopra il bacino (frecce nella Figura 1A). Con una mano che tiene quelle fosse, usa l'altra mano per premere delicatamente e sentire la colonna vertebrale dalla direzione caudale a quella rostrale e trovare la prima grande rientranza tra le vertebre, e questo è lo spazio intervertebrale tra le vertebre sacrali 1 (S1) e lombari 6 (L6) (Figura 1B).
2. Muoversi leggermente rostralmente per identificare la successiva rientranza, lo spazio intervertebrale tra le vertebre lombari 5 (L5) e L6 e il sito di iniezione (* nella Figura 1A). Utilizzare un bisturi per praticare un'incisione lunga non più di 2 cm nella pelle lungo la linea mediana dal rostrale alla caudale in modo che il sito di iniezione sia al centro dell'incisione (linea tratteggiata nella Figura 1A).
3. Usa le forbici da dissezione per sezionare il tessuto connettivo per visualizzare lo strato muscolare. Quindi, praticare un'incisione di 1 cm nella capsula muscolare immediatamente lateralmente al processo spinale dorsale della vertebra lombare L6.
   NOTA: A questo punto è stato possibile visualizzare le ossa della vertebra lombare L6.
4. Posizionare il gruppo cannula-ago guida vicino alla faccia anteriore della 6a vertebra lombare e spingerlo nello spazio intervertebrale lungo la faccia anteriore della 6a vertebra in modo che l'estremità dell'ago penetri nel canale spinale. Spingere la cannula guida in posizione lungo l'ago e rimuovere l'ago 23-G, lasciando in posizione solo la cannula guida.
   NOTA: È utile utilizzare una pinza smussata per individuare il processo dorsale della vertebra lombare L6 prima di inserire l'ago. Generalmente, il liquido cerebrospinale (CSF) può essere visto entrare nel mozzo dell'ago (questo fluido può essere tinto con un pizzico di sangue, ma questo non indica che sia stato fatto un danno o che l'ago non sia posizionato correttamente). Gli autori non hanno visto una grande quantità di sangue o gravi emorragie durante questa procedura. In uno dei due casi, è necessario contattare un veterinario per determinare il trattamento appropriato e se gli animali devono essere soppressi.
5. Inserire il gruppo catetere-filo nella cannula guida. Inclinare il catetere verso il basso di circa 45° rispetto al canale spinale e forzare l'estremità di circa 0,3 cm nel canale spinale.
6. Rimuovere la cannula guida, lasciando il catetere con il filo dello stiletto in posizione. Rimuovere il filo dello stiletto a circa 2,5 cm dalla punta intratecale del catetere e far avanzare il catetere nel canale spinale fino a quando il segno di 2 cm si trova all'ingresso del canale (appena visibile sotto il muscolo), come mostrato nella Figura 2Bvi.
   NOTA: Il catetere inserito deve estendersi rostralmente nello spazio subaracnoideo. Un posizionamento riuscito dovrebbe consentire al catetere di muoversi liberamente in quello spazio.
7. Ritirando completamente il filo dello stiletto, si può vedere il liquido cerebrospinale entrare nel catetere impiantato.
8. Collegare il gruppo del catetere di erogazione all'estremità distale del catetere impiantato tramite l'estremità dell'ago da 30 G (Figura 2Bv, vi).
9. Caricare 60 μl di soluzione fisiologica sterile in una siringa da 100 μl (siringa di lavaggio). Caricare un bolo di 30 μl del composto in esame (ad es. oligonucleotide antisenso o soluzione ASO) in una seconda siringa (siringa per iniezione).
10. Collegare la siringa di lavaggio (caricata con soluzione fisiologica) all'estremità dell'adattatore del tubo del gruppo catetere di erogazione (Figura 2Bv). Iniettare 20 μL di soluzione fisiologica sterile nello spazio intratecale (lavaggio pre-iniezione).
11. Collegare la siringa per iniezione (caricata con il composto di prova) all'estremità dell'adattatore del tubo del gruppo catetere di erogazione (Figura 2Bv). Iniettare 30 μL di composto di prova nello spazio intratecale per 30 s.
    NOTA: Il volume di iniezione di routine di ASO è di 30 μL per ottenere un buon knockdown nel midollo spinale e nella corteccia. È stato riportato che i volumi di iniezione possono influire sulla distribuzione del composto, sebbene non siano stati testati volumi di iniezione diversi. Se viene utilizzato un altro composto o volume, la sicurezza e l'efficacia devono essere determinate empiricamente.
12. Ripetere il passaggio 1.10 e lavare il catetere con altri 40 μl di soluzione fisiologica sterile (lavaggio post-iniezione). Quindi staccare il gruppo del catetere di rilascio dal catetere impiantato.
    NOTA: Si ritiene che il lavaggio pre e post iniezione riduca il sequestro locale dei composti e migliori la loro distribuzione alle strutture rostrali.
13. Per tagliare e sigillare a caldo in modo asettico il catetere impiantato, posizionare un paio di pinze sterili per dissezione in uno sterilizzatore a perline fino a quando non sono molto calde, quindi serrare il tubo con l'estremità calda della pinza.
    NOTA: Questa azione scioglie il catetere. Pertanto, il foro nel tubo collassa e tutti i lati si attaccano l'uno all'altro, sigillando il tubo in modo asettico. Quindi, viene inserito nello spazio sottocutaneo.
14. Utilizzare suture monofilamento riassorbibili per fissare il catetere termosaldato rimanente al tessuto connettivo. Quindi, utilizzare suture monofilamento non assorbibili per chiudere la pelle sopra il catetere termosaldato fissato.
    NOTA: Le clip per ferite possono essere utilizzate anche come approvato dal protocollo del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC). La tecnica è compatibile con iniezioni ripetute, sebbene sia stata utilizzata solo per iniezioni una tantum nelle nostre mani. La fattibilità di iniezioni ripetute dovrebbe essere valutata empiricamente con l'approvazione dell'IACUC.
15. Utilizzare garze e soluzione salina per lavare il sangue dalla pelle e consentire all'animale di riprendersi dall'anestesia in un'incubatrice riscaldata fino a quando non si sposta, a quel punto viene riportato nella sua gabbia di casa (due ratti per gabbia).
    NOTA: Quando si eseguono interventi chirurgici su più ratti nello stesso giorno, pulire gli strumenti utilizzando acqua per rimuovere il sangue e risterilizzare utilizzando uno sterilizzatore a perline a secco riscaldato (per almeno 20 s, con il tempo di raffreddarsi) tra gli animali. Un nuovo set di strumenti viene utilizzato ogni 5 animali.
16. Monitorare gli animali quotidianamente per almeno 3 giorni dopo l'intervento chirurgico e continuare a monitorarli settimanalmente dopo l'intervento, secondo il protocollo IACUC.

Risultati

Figura 1: Identificazione del sito di iniezione e della linea di incisione. (A) Con l'addome del ratto sostenuto da un tubo conico da 50 mL, le due fosse tra i muscoli sopra il bacino sono facilmente visibili (frecce). (B) Con una mano che tiene le fosse...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
BD intramedic PE	BD	Tubo in polietilene PE50, diametro 0.023 in	BD 427400 (10 ft, Fischer Scientific 22-204008) o 427401 (100 ft, Fischer Scientific 14-170-12P)
BD intramedic PE tubo	BD	Tubo in polietilene PE10, diametro 0,011 pollici	BD 427410 (10 piedi, Fischer Scientific 14-170-11B) o 4274011 (100 piedi, Fischer Scientific 14-170-12B)
Aghi monouso BD PrecisionGlide 30G	BD		BD
305128 Cannula guida	BD	19G x 1 WT (1,1 mm x 25 mm) Ago	BD 305186
Siringa Hamilton 100 ul	Azienda Hamilton	Siringa Hamilton 100 ul
Sterilizzatore a cordone caldo	Fine Science Tools		Sterilizzatore modello n. FST 250
Scrub povidone	PDI		S48050
Soluzione salina	Baxter	Cloruro di sodio 0,9% per infusione endovenosa BP 50 ml	FE1306G
Piuma di bisturi		Bisturi monouso	n. 10
Termoforo per piccoli animali	K&H Manufacturing		Modello n. 1060
Filo stiletto	McMaster-Carr	1749T14	LH-36233780
Telo per asciugamani chirurgici	Dynarex		4410
Forbici e pinze chirurgiche	FST e Fisher Scientific
Sutures	Ethicon		4-0 o 5-0
Fonte alternativa per materiali prefabbricati e sterilizzati per questa procedura
Catetere dosatore sistema	Sistemi di infusione		RIDC-01
Cannula guida	di infusione		Cateteri interni RIDC-GCA
Sistemi	di infusione		RIDC-INC
Filo con stiletto	Sistemi di infusione		RIDC-STY

tubo SAI Sistemi SAI SAI SAI