Valutazione del trattamento con plasma a pressione atmosferica in cellule di neuroblastoma prive di glucosio

Abstract

Fonte: Yan, X., et. al., Nuova applicazione di un getto di plasma a pressione atmosferica come agente neuroprotettivo contro il danno indotto dalla privazione di glucosio delle cellule SH-SY5Y. J. Vis. Exp. (2017)

Il video dimostra l'attività neuroprotettiva del trattamento al plasma a basse dosi a pressione atmosferica in cellule di neuroblastoma prive di glucosio modulando lo stress ossidativo e migliorando la vitalità cellulare.

Protocollo

1. Trattamento APPJ (Atmospheric Pressure Plasma Jet) di SH-SY5Y

1. Regolare la distanza tra l'ugello del tubo di quarzo e la piattaforma in cui verrà posizionata la piastra a 96 pozzetti a 3 cm. Assicurarsi che il raggio possa toccare la superficie del terreno di coltura.
   NOTA: La distanza non viene misurata dal fondo della piastra. Viene prima regolato a 3 cm tra l'ugello del tubo di quarzo e la piattaforma utilizzata per posizionare la piastra a 96 pozzetti.
2. Prima del trattamento APPJ (Atmospheric Pressure Plasma Jet), cambiare il terreno di coltura in ciascun pozzetto, ad eccezione dei pozzetti di controllo, con RPMI 1640 senza mezzo di glucosio.
3. Posizionare la piastra sotto l'ugello APPJ e assicurarsi che i getti possano sparare verticalmente in ogni pozzetto.
4. Trattare le cellule in pozzetti separati con APPJ per 0 s, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s e 12 s.
   NOTA: APPJ è generato da elio ionizzante (Figura 1). Le cellule danneggiate dalla privazione di glucosio vengono trattate con un flusso di elio di 4 s e 8 s per eliminare gli effetti dell'elio sulle cellule. Tutti i trattamenti devono essere eseguiti in triplice copia.

2. Saggio di vitalità cellulare

NOTA: Non cambiare il terreno in questo passaggio.

1. Dopo il trattamento con APPJ, incubare le cellule per 1 ora in un incubatore cellulare.
2. Aggiungere 10 μl di soluzione Cell Counting Kit-8 (CCK-8) a ciascun pozzetto.
3. Incubare le cellule a 37 °C per 4 h.
   NOTA: La linea cellulare SH-SY5Y è sensibile alle condizioni di privazione di glucosio. La vitalità cellulare diminuisce a quasi il 50% dopo 1 ora di privazione di glucosio, che è la condizione ottimale di vitalità cellulare per gli studi di farmacodinamica. CCK-8 non ha citotossicità per le cellule e le cellule vengono incubate con il reagente CCK-8 per altre 4 ore nelle condizioni di privazione di glucosio dopo il trattamento con APPJ per verificare la vitalità cellulare. Dopo 8 ore di deprivazione di glucosio e trattamento con APPJ, l'effetto protettivo dell'APPJ è stato significativamente ridotto perché la lunga durata della privazione di glucosio ha portato a gravi danni alle cellule SH-SY5Y. Non c'era evidenza di cellule viventi dopo 24 ore di privazione di glucosio.
4. Misurare l'assorbanza a 450 nm con un lettore di micropiastre.

Risultati

Figura 1: Tipiche reazioni RNS (specie reattive dell'azoto) e ROS (specie reattive dell'ossigeno) nelle emissioni APPJ (Atmospheric Pressure Plasma Jet).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
SH-SY5Y linea cellulare	China Center for Type Culture Collection	3111C0001CCC000026
RPMI 1640 medium	Thermo Scientific	21875091	Conservato a 4 °C
RPMI 1640 medium senza glucosio	Thermo Scientific	11879020	Conservato a 4 °C
Siero fetale di vitello	Thermo Scientific	16000044	Conservato a -20 °C
96 pozzetti piastra	corning	3599
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Dojindo Laboratories	CK04	Conservato a 4 °C
Lettore di micropiastre	Tecan	M200 Pro	Per misurare l'assorbanza a 450 nm
Amplificatore di potenza ad alta tensione	Trek	PD06087	Per amplificare la
potenza Funzione Generatore di segnale	MaZe Electronics Science&Technology	AT30120	Per fornire il segnale specifico
Sonda ad alta tensione	Tektronix	P6015A	Per il rilevamento
dell'oscilloscopio digitale	Tektronix	DPO4104B	Per la visualizzazione del segnale

ad alta tensione