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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Posizionamento del mouse
1. Valutare il livello di anestesia mediante il riflesso del pedale (pizzicamento deciso delle dita) per mantenere il piano chirurgico.
2. Posiziona il dispositivo di posizionamento a una distanza e un'altezza adeguate in modo da fornire un comodo accesso a tutti i reagenti necessari.
3. Una volta che i topi sono adeguatamente anestetizzati, solleva delicatamente ogni topo per la collottola con il pollice e l'indice e posizionalo sulla sedia designata.
4. Il corretto posizionamento del mouse sulla sedia è molto importante in questa fase. Appoggiare la schiena del mouse parallelamente al supporto dello schienale della sedia e a 90° rispetto al sedile della sedia. Sollevare le mani dal mouse e lasciare che l'animale si sdrai naturalmente nella posizione della testa verso il basso e in avanti, senza spingere o premere, come mostrato nella Figura 1B. Assicurati che gli arti anteriori del topo forniscano un supporto naturale mentre l'animale è in questa posizione rilassata, senza alcun disagio per il topo.
5. Una volta che i topi sono posizionati correttamente, allacciali con la cintura della sedia e inizia immediatamente l'inoculazione intranasale.
2. Somministrazione intranasale (IN)
NOTA: Questo protocollo descrive la somministrazione IN di complessi RVG9R:siRNA utilizzando il dispositivo di posizionamento del mouse. Utilizzando questo protocollo, un massimo di 20-30 μL di soluzione può essere facilmente somministrato a ciascun topo in gocce da 2 μL. Questo volume è inferiore a quello della cavità nasale del topo, che è di 0,032 cm3, quindi la procedura non provoca ostruzione letale delle narici o asfissia. Questo protocollo consente l'inoculazione simultanea di almeno quattro topi e un massimo di otto topi per dispositivo, con conseguente ottimizzazione dei tempi e riduzione della variabilità.
1. Prendi la micropipetta da 10 μL e regolala a 2 μL.
2. Caricare la micropipetta con 2 μL di soluzione complessa RVG9R:siRNA (ad esempio, 5,2 μg di siCy5 complessato con 104 μg di RVG9R per l'esperimento di somministrazione e 13,5 μg di siSOD1 complessato con 270 μg di RVG9R per l'esperimento di silenziamento, in un volume finale di 25 μL di PBS contenente il 5% di glucosio.
3. Tenendo la pipetta nella mano dominante, regola la posizione posizionando un gomito sul piano del banco. Sostenere la mano che tiene la pipetta con l'altra mano per evitare movimenti incontrollati durante la somministrazione.
4. Posiziona una goccia di ~2 μL molto vicino a una narice in modo che il topo possa inalare direttamente la goccia (fare riferimento alla Figura 1B). Se non si forma facilmente una piccola goccia, sostituire il puntale della pipetta con uno nuovo e ripetere l'operazione. Utilizzare il cronometro per verificare l'intervallo di tempo tra le inoculazioni.
5. Questo dispositivo permette il trattamento di almeno quattro topi alla volta. Se è necessario ripetere il passaggio 2.4 da un altro gruppo di topi, impostare un'altra barra con quattro sedie sopra o sotto la prima barra con quattro sedie per ospitare fino a otto mouse alla volta sul dispositivo.
6. Ripeti il passaggio 2.4 con l'altra narice dopo 3-4 minuti dalla prima inoculazione. Questo intervallo di tempo è sufficiente affinché il topo completi l'inalazione della prima dose e ripristini la normale respirazione. Se una goccia della soluzione inalata viene rimossa a causa di uno sniffare accidentale dal narice del topo, reinoculare altri 2 μL di soluzione.
7. Ripeti l'intero processo con narici alternate fino a quando la dose di 20-30 μL è terminata. Ci vorranno ~30-45 minuti per completare l'intera procedura di inoculazione.
8. Metti un unguento umido sugli occhi dei topi prima di riportare i topi nelle loro gabbie designate.
NOTA: Non lasciare i topi incustoditi fino a quando non hanno riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale.
