Isolamento e purificazione di glicoproteine oligodendrocitarie mieliniche ricombinanti

Abstract

Fonte: Jain, R. W., et al. Produzione e purificazione semplici ed efficienti della glicoproteina oligodendrocitaria della mielina di topo per studi sperimentali sull'encefalomielite autoimmune. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra l'isolamento e la purificazione di MOGtag, una glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG) ricombinante utilizzata negli studi sperimentali sull'encefalomielite autoimmune (EAE). Il protocollo prevede la lisi batterica, la sonicazione, la centrifugazione e la cromatografia di affinità del nichel per ottenere MOGtag purificato. Questa proteina consente la ricerca sull'autoimmunità mediata dalle cellule B in modelli di sclerosi multipla.

Protocollo

1. Raccolta della proteina MOGtag

NOTA: In questa fase, i batteri avranno prodotto grandi quantità di proteina MOGtag. Per raccogliere il MOGtag, i batteri vengono prima lisati in un tampone Triton X-100, seguiti dalla sonicazione. MOGtag viene quindi rilasciato dai corpi di inclusione e denaturato con imidazolo e guanidina, ottenendo una soluzione proteica grezza contenente la proteina MOGtag.

1. Prelevare un'aliquota da 1 ml da una delle colture notturne e trasferirla in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Pellettare le celle a 16.000 x g per 1 minuto e rimuovere il surnatante. Etichettare la provetta su TO/N (post-induzione), quindi mettere il pel....

Risultati

Figura 1: Panoramica dei passaggi necessari per produrre la proteina MOGtag pura. Per generare la proteina MOGtag, i batteri che esprimono la proteina MOGtag vengono cresciuti ad alte densità e quindi indotti a esprimere MOGt.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
BL21 E.coli- pet32-MOGtag	Kerfoot lab		Questi batteri sono necessari per produrre la proteina MOGtag. Le scorte di glicerolo di questi batteri sono disponibili su richiesta.
LB brodo mugnaio	Bioshop	LBL407.1
Ampicillina	Bio basic	AB0028	Ricostituire la polvere in 50% etanolo/ 50% H₂O a 100 mg/ml. Conservare a -20 °C.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	Ricostituire la polvere in H₂O a 1M e conservare a -20 °C.
Lisozima uovo di gallina	Bioshop	LYS702.10	Ricostituire in H₂O a 50 mg/ml e conservare a -80 °C.
Triton-X100	Sigma	T-8532
Soluzione salina tamponata con fosfato	Life technologies	20012-027	Non è richiesta una soluzione salina tamponata con fosfato commerciale, è sufficiente una soluzione salina tamponata con fosfato standard prodotta in laboratorio.
Cloruro di sodio	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
Imidazole	Bioshop	IMD508.100
Guanidina-HCl	Sigma	G3272	La qualità deve essere superiore al 98% di purezza.
0,5 M EDTA	bioshop	EDT111.500
Solfato di nichel (II)	Bioshop	NIC700.500
La sua resina legante	EMD Millipore	69670-3	Conservare in etanolo al 20% H₂O 80% H₂O a 4 °C
Etanolo anidro	Alcoli commerciali	P016EAAN	Diluire con acqua secondo necessità.
Acido acetico glaciale	Bioshop	ACE222.1
Acetato di sodio triidrato	Bioshop	SAA305.500
Albumina sierica bovina standard	bio-rad	500-0206
Acido etilendiammina tetraacetico, sale disodico diidrato	Fisher scientific	BP120-500
Polietilenglicole 3350	Bioshop	PEG335.1
polietilenglicole 8000	Bioshop	PEG800.1
Sonicatore	Fisher scientific	FB-120-110
Sodio dodecil solfato	Bioshop	SDS001