Isolamento e purificazione di glicoproteine oligodendrocitarie mieliniche ricombinanti

Abstract

Fonte: Jain, R. W., et al. Produzione e purificazione semplici ed efficienti della glicoproteina oligodendrocitaria della mielina di topo per studi sperimentali sull'encefalomielite autoimmune. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra l'isolamento e la purificazione di MOGtag, una glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG) ricombinante utilizzata negli studi sperimentali sull'encefalomielite autoimmune (EAE). Il protocollo prevede la lisi batterica, la sonicazione, la centrifugazione e la cromatografia di affinità del nichel per ottenere MOGtag purificato. Questa proteina consente la ricerca sull'autoimmunità mediata dalle cellule B in modelli di sclerosi multipla.

Protocollo

1. Raccolta della proteina MOGtag

NOTA: In questa fase, i batteri avranno prodotto grandi quantità di proteina MOGtag. Per raccogliere il MOGtag, i batteri vengono prima lisati in un tampone Triton X-100, seguiti dalla sonicazione. MOGtag viene quindi rilasciato dai corpi di inclusione e denaturato con imidazolo e guanidina, ottenendo una soluzione proteica grezza contenente la proteina MOGtag.

1. Prelevare un'aliquota da 1 ml da una delle colture notturne e trasferirla in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Pellettare le celle a 16.000 x g per 1 minuto e rimuovere il surnatante. Etichettare la provetta su TO/N (post-induzione), quindi mettere il pellet batterico in un congelatore a -20 °C per la futura analisi della pagina SDS (Figura 2).
2. Distribuire uniformemente i fermenti in flaconi da 250 ml compatibili con la centrifugazione ad alta velocità e tenerli in ghiaccio da questo punto in poi. Pellettare le cellule batteriche a 22.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
3. Scartare il surnatante. Conservare i pellet batterici a -20 °C o continuare con il passaggio 1.4.
4. Preparare il tampone di lisi (0,1 mg/ml di lisozima d'uovo di gallina, 0,1% di Triton-X (v/v) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)) aggiungendo 60 μl di Triton X-100 e 120 μl di 50 mg/ml di soluzione madre di lisozima d'uovo di gallina a 60 mL di PBS.
5. Risospendere e combinare tutti i pellet batterici del passaggio 1.3 in un totale di 30 ml di tampone di lisi. Trasferire questo volume in una provetta da 50 ml a fondo tondo in grado di eseguire una centrifugazione ad alta velocità. Mettere questo tubo in un bagnomaria a 30 °C per 30 minuti. Durante il tempo di incubazione, agitare la provetta due volte per risospendere le cellule.
6. Dopo l'incubazione, trasferire il tubo sul ghiaccio e sonicare la soluzione a 20 kHz, ampiezza 70%, impulso acceso per 3 secondi, impulso spento per 3 secondi e cinque impulsi per giro. Sonicare la soluzione per sei round totali e lasciare che la soluzione si raffreddi sul ghiaccio tra un round e l'altro.
7. Centrifugare la soluzione a 24.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante e ripetere i passaggi 1,5-1,7 una volta. Conservare il pellet a -20 °C o continuare con il passaggio 1.8.
8. Preparare il tampone A (500 mM di NaCl (cloruro di sodio), 20 mM di Tris-HCl (Tris (idrossimetil)amminometano cloridrato), 5 mM di imidazolo, pH 7,9) aggiungendo 0,8766 g di NaCl, 0,09456 g di Tris-HCl e 0,01021 g di imidazolo a un becher da 100 ml. Aggiungere acqua fino a raggiungere il volume di 28 ml, quindi regolare il pH della soluzione a 7,9. Quindi, trasferire la soluzione in un cilindro graduato da 100 ml e aggiungere acqua fino a raggiungere il volume di 30 ml.
9. Risospendere il pellet del passaggio 1.7 in 30 ml di tampone A e incubare questa soluzione a 4 °C per 3 ore. Durante questo periodo, pesare 17,2 g di guanidina-HCl.
10. Sonicare la soluzione sul ghiaccio utilizzando le stesse impostazioni del passaggio 1.6. Quindi aggiungere 17,2 g di guanidina-HCl alla soluzione. Incubarlo su ghiaccio per 1 ora per solubilizzare la proteina MOGtag.
11. Centrifugare la soluzione a 24.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Raccogliere il surnatante e conservare il surnatante a 4 °C fino alla purificazione delle proteine.

2. Purificazione delle proteine

NOTA: Nelle fasi successive, la proteina MOGtag verrà purificata attraverso 4 cicli di assorbimento su resina di nichel caricata (tramite l'His-tag) e l'eluizione.

1. Prepara i seguenti tamponi:
   1. Prepara il tampone B (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazolo, 6 M guanidina-HCl, pH 7.9). Aggiungere 5,844 g di NaCl, 0,6304 g di Tris-HCl, 0,0681 g di imidazolo e 114,64 g di guanidina-HCl in un becher da 500 ml. Quindi aggiungere acqua fino a raggiungere i 190 ml e regolare il pH a 7,9. Trasferire la soluzione in un cilindro graduato da 250 ml e aggiungere acqua fino a raggiungere un volume di 200 ml.
   2. Preparare il tampone di eluizione (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M imidazolo, 6 M guanidina-HCl, pH 7,9). Aggiungere 5,844 g di NaCl, 0,6304 g di Tris-HCl, 6,808 g di imidazolo e 114,64 g di guanidina-HCl in un becher da 500 mL. Aggiungere acqua fino a raggiungere i 190 ml e regolare il pH a 7,9. Trasferire la soluzione in un cilindro graduato da 250 ml e aggiungere acqua fino a raggiungere un volume di 200 ml.
   3. Preparare il tampone per strisce (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA (acido etilendiammina tetraacetico), pH 7,9). Aggiungere 5,844 g di NaCl, 0,6304 g di Tris-HCl, 40 ml di EDTA da 500 mM in un becher da 500 mL. Aggiungere acqua fino a raggiungere i 190 ml e regolare il pH a 7,9. Trasferire la soluzione in un cilindro graduato da 250 ml e aggiungere acqua fino a raggiungere un volume di 200 ml.
   4. Preparare il tampone di carica (0,1 M di solfato di nichel). Aggiungere 5,257 g di solfato di nichel in un becher da 500 ml e aggiungere acqua fino a raggiungere i 190 ml (ATTENZIONE, non maneggiare il solfato di nichel al di fuori di una cappa aspirante fino a quando il solfato di nichel non si è sciolto in acqua). Una volta sciolto il solfato di nichel, trasferire la soluzione in un cilindro graduato da 250 ml e aggiungere acqua fino a raggiungere il volume di 200 ml.
2. Dividere 10 ml di resina di nichel tra due provette da centrifuga coniche da 50 ml in grado di resistere a forze centrifughe superiori a 4.500 x g (5 ml in ciascuna provetta).
3. Carica ed equilibra la resina di nichel:
   1. Lava la resina aggiungendo 40 ml di acqua a ogni tubo contenente la resina. Appoggiare i tubi orizzontalmente su un bilanciere e lasciarli agitare per 5 minuti a 4 °C. Una volta terminato, centrifugare le provette a 4.500 x g per 8 min a 4 °C.
   2. Scartare il surnatante pipettandolo per evitare di disturbare il pellet. Aggiungere 40 ml di tampone di carica in ogni provetta. Trasferire i tubi su un bilanciere e lasciarli agitare per 15 minuti a 4 °C. Una volta terminato, centrifugare le provette a 4.500 x g per 8 min a 4 °C.
   3. Eliminare il surnatante, quindi aggiungere 40 ml di tampone B alle provette. Trasferire i tubi su un bilanciere e lasciarli agitare per 5 minuti a 4 °C. Una volta terminato, centrifugare le provette a 4.500 x g per 8 minuti a 4 °C, quindi scartare i surnatanti.
4. Opzionale: prelevare 150 μl della proteina solubilizzata raccolta nella fase 1.11 e trasferirla in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Etichettare la provetta come pre-incubazione e congelarla a -20 °C per le future analisi della SDS (sodio dodecil solfato) (Figura 2, MOGtag grezzo).
5. Purificare la proteina MOGtag:
   1. Trasferire l'intero volume di proteina solubilizzata dal passaggio 1.11 (~40 ml, meno il piccolo campione rimosso nel passaggio 2.4) alla prima provetta (Figura 1, tubo 1) contenente resina di nichel dal passaggio 2.3, mescolare e posizionare orizzontalmente su un bilanciere a 4 °C per 1 ora.
   2. Centrifugare la provetta a 4.500 x g per 8 minuti a 4 °C. Una volta terminato, trasferire il surnatante nella seconda provetta (Figura 1, provetta 2) di resina di nichel e incubare come descritto nel passaggio precedente. Nel frattempo, continuare con i passaggi da 3 a 6 di seguito con il tubo 1.
   3. Risospendere la resina di nichel nella provetta 1 in 40 ml di tampone di eluizione e posizionare la provetta orizzontalmente su un bilanciere a 4 °C per 5 minuti. Quindi, centrifugare la provetta a 4.500 x g per 8 minuti a 4 °C.
   4. Trasferire il surnatante contenente la proteina MOGtag eluita in un flacone da 250 ml con l'etichetta "proteina MOGtag purificata" e conservare il flacone a 4 °C. Ad ogni fase di eluizione, raccogliere il surnatante risultante in questo flacone.
   5. Aggiungere 40 ml di tampone a strisce alla resina di nichel e posizionarla orizzontalmente su un bilanciere per 5 minuti a 4 °C.
   6. Centrifugare la provetta a 4.500 x g per 8 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante, quindi ricaricare la resina di nichel come elencato al punto 2.3.
   7. Una volta terminato, procedere con il secondo tubo come elencato al punto 2.5. Un totale di 4 cicli di assorbimento della proteina solubilizzata dal passaggio 1.11 sulla resina di nichel caricata e l'eluizione recupereranno la maggior parte della proteina sebbene, se lo si desidera, sia possibile recuperare ulteriori proteine in ulteriori cicli di assorbimento ed eluizione.
6. Una volta completati quattro (o più) cicli di assorbimento ed eluizione, conservare la proteina purificata a 4 °C per una notte. La resina di nichel può essere conservata in 40 ml di una soluzione di etanolo al 20% a 4 °C fino a quando non è nuovamente necessaria.

Risultati

Figura 1: Panoramica dei passaggi necessari per produrre la proteina MOGtag pura. Per generare la proteina MOGtag, i batteri che esprimono la proteina MOGtag vengono cresciuti ad alte densità e quindi indotti a esprimere MOGtag utilizzando l'IPTG come elencato nella sezione 1. Dopo la coltura notturna, i batteri vengono lisati e, attraverso una serie di fasi di pellettatura, viene estratta la frazione proteica contenente corpi di inclusione, che contiene MOGtag, come elencato nella sezione 1. MOGtag viene quindi purificato dalla frazione proteica grezza attraverso quattro cicli di assorbimento su resina di nichel carica e l'eluizione della proteina MOGtag come elencato nella sezione 2. Una parte dell'eluato aggregato viene quindi prelevata per un saggio di Bradford per determinare la resa della proteina MOGtag e il resto dell'eluato viene dializzato in tampone acetato nel corso di diversi giorni. Infine, la proteina viene concentrata utilizzando PEG (polietilenglicole) 3350 e PEG 8000 a una concentrazione finale di 5 mg/ml in base alla resa di MOGtag determinata nel test di Bradford come elencato nella sezione 6. L'intero processo può richiedere un minimo di 10 giorni, con il giorno di inizio per ogni passaggio mostrato tra parentesi. Tuttavia, nel protocollo sono elencati punti di arresto e di inizio alternativi e, se lo si desidera, i passaggi possono essere distribuiti su un periodo di tempo maggiore.

Figura 2: Purificazione della proteina MOGtag e valutazione della sua attività. (A)  Sono mostrati campioni di proteine che sono stati raccolti da vari punti durante la procedura di purificazione delle proteine ed eseguiti su un gel SDS-PAGE (elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide). T0= Batteri BL21 prima dell'induzione proteica, TO/N= Batteri BL21 post-induzione dell'espressione proteica, MOGtag grezzo= Proteina MOGtag solubilizzata prima della purificazione delle proteine, MOGtag puro= Proteina MOGtag dopo la purificazione. (B) Il legame della proteina MOGtag alle cellule B CD19pos CD4neg naïve dai linfonodi di topi C57Bl/6 wild-type o di topi IgHMOG che esprimono una catena pesante di immunoglobuline specifica per la proteina MOG è stato valutato utilizzando la citometria a flusso. Le cellule B specifiche per MOGtag sono state identificate colorando le cellule linfonodali con MOGtag seguito da un anticorpo secondario anti-his tag e da un anticorpo terziario fluorescente anti-IgG1. La colorazione delle cellule di topi C57BL/6 o IgHMOG è mostrata insieme a una colorazione di controllo a fluorescenza MOGtag meno uno (FMO) delle cellule IgHMOG.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
BL21 E.coli- pet32-MOGtag	Kerfoot lab		Questi batteri sono necessari per produrre la proteina MOGtag. Le scorte di glicerolo di questi batteri sono disponibili su richiesta.
LB brodo mugnaio	Bioshop	LBL407.1
Ampicillina	Bio basic	AB0028	Ricostituire la polvere in 50% etanolo/ 50% H₂O a 100 mg/ml. Conservare a -20 °C.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	Ricostituire la polvere in H₂O a 1M e conservare a -20 °C.
Lisozima uovo di gallina	Bioshop	LYS702.10	Ricostituire in H₂O a 50 mg/ml e conservare a -80 °C.
Triton-X100	Sigma	T-8532
Soluzione salina tamponata con fosfato	Life technologies	20012-027	Non è richiesta una soluzione salina tamponata con fosfato commerciale, è sufficiente una soluzione salina tamponata con fosfato standard prodotta in laboratorio.
Cloruro di sodio	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
Imidazole	Bioshop	IMD508.100
Guanidina-HCl	Sigma	G3272	La qualità deve essere superiore al 98% di purezza.
0,5 M EDTA	bioshop	EDT111.500
Solfato di nichel (II)	Bioshop	NIC700.500
La sua resina legante	EMD Millipore	69670-3	Conservare in etanolo al 20% H₂O 80% H₂O a 4 °C
Etanolo anidro	Alcoli commerciali	P016EAAN	Diluire con acqua secondo necessità.
Acido acetico glaciale	Bioshop	ACE222.1
Acetato di sodio triidrato	Bioshop	SAA305.500
Albumina sierica bovina standard	bio-rad	500-0206
Acido etilendiammina tetraacetico, sale disodico diidrato	Fisher scientific	BP120-500
Polietilenglicole 3350	Bioshop	PEG335.1
polietilenglicole 8000	Bioshop	PEG800.1
Sonicatore	Fisher scientific	FB-120-110
Sodio dodecil solfato	Bioshop	SDS001