Regolazione della crescita delle cellule di Schwann in vitro utilizzando la tecnica del campo elettrico pulsato a nanosecondi

Abstract

Fonte: Han, J., et.al. Regolazione della crescita delle cellule di Schwann mediante campo elettrico pulsato al nanosecondo per la rigenerazione dei nervi periferici in vitro. J. Vis. Exp. (2024)

Questo video mostra l'applicazione della tecnica del campo elettrico pulsato a nanosecondi (nsPEF) per modulare la crescita delle cellule di Schwann (SC). I rapidi impulsi elettrici inducono nanopori transitori nelle membrane SC, facilitando l'afflusso di calcio che attiva le vie di segnalazione che guidano la proliferazione, la dedifferenziazione e la secrezione di fattori neurotrofici. Queste risposte cellulari migliorano il supporto assonale, la sopravvivenza neuronale e la potenziale mielinizzazione, evidenziando nsPEF come uno strumento promettente per la riparazione dei nervi.

Protocollo

1. Scongelamento delle cellule RSC96 crioconservate

1. Scongelare il crioviale contenente 1 mL di sospensione cellulare agitandolo rapidamente in un bagno d'acqua a 37 °C, quindi aggiungerlo a una provetta da centrifuga contenente 4-6 mL di terreno di coltura completo e mescolare bene.
2. Centrifugare a 1000 x g per 3-5 minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 3 mL di terreno di coltura completo.
3. Aggiungere la sospensione cellulare a un pallone di coltura (o piatto) contenente 6-8 mL di terreno di coltura completo e incubare a 37 °C per una notte.
4. Il giorno successivo, osserva la crescita e la densità cellulare al microscopio.

2. Passaggio cellulare:

NOTA: se la densità cellulare raggiunge l'80%-90%, è pronto per il passaggio.

1. Eliminare il terreno di coltura e sciacquare le cellule 1-2 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza ioni calcio e magnesio.
2. Aggiungere lo 0,25% (p/v) di tripsina-0,53 mM EDTA al pallone di coltura (1-2 mL per un pallone T25, 2-3 mL per un pallone T75) e incubare a 37 °C per 1-2 min.
3. Osservare il distacco cellulare al microscopio. Se la maggior parte delle cellule diventa rotonda e si stacca, riportare rapidamente il pallone nell'area di lavoro, picchiettare delicatamente il pallone e aggiungere 3-4 mL di terreno di coltura contenente il 10% di FBS per fermare la digestione.
4. Mescolare il contenuto, aspirare la soluzione e centrifugare a 1000 x g per 5 min. Quindi, scartare il surnatante e risospendere le cellule aggiungendo 1-2 mL di terreno di coltura fresco e pipettando delicatamente.
5. Trasferire la sospensione cellulare in un nuovo matraccio T25 in rapporto 1:2 e aggiungere 7 mL di terreno di coltura.

3. Funzionamento del dispositivo nsPEF

1. Risospendere le cellule RSC96 in 1 mL di terreno di coltura DMEM e trasferirle in piastre colorimetriche con elettrodi su entrambi i lati.
2. Accendere l'interruttore di alimentazione.
3. Regolare i parametri ruotando la manopola sullo strumento per modificare l'intensità del campo elettrico. Le intensità stabilite in questo studio sono 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm e 40 kV/cm.
4. Ruotare con cautela gli elettrodi fino a quando non compaiono scintille, consentendo alle celle di ricevere 5 impulsi di nsPEF in base alle intensità di campo preimpostate prima di separare immediatamente i due elettrodi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Alimentatore ad alta tensione per nsPEF	Matsusada Precision Inc.	AU-60P1.6-L
Pipetta	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
RSC96 Celle Schwann	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	STCC30007G-1
Scanister	3DHISTECH	Pannoramic MIDI
Cavo speciale per nsPEF	Times Microwave Systems	M17/78-RG217