Un'iniezione di vettore virale nel midollo spinale del ratto per il tracciamento neuronale retrogrado

Abstract

Fonte: Keefe, K. M., et al. L'iniezione diretta di un vettore lentivirale evidenzia molteplici vie motorie nel midollo spinale del ratto. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra l'iniezione di un vettore virale di trasporto retrogrado (HiRet) altamente efficiente nel midollo spinale del ratto per tracciare i percorsi neuronali. Il virus ha glicoproteine per l'ingresso sinaptico e un gene codificante una proteina fluorescente. L'ago viene inserito nel midollo spinale e la sospensione virale viene somministrata a una velocità controllata. L'ago viene infine ritirato dopo aver concesso un tempo sufficiente per la diffusione virale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Prepara

1. gli aghi di vetro estratti per l'iniezione virale alcuni giorni prima dell'intervento utilizzando pipette capillari di vetro da 3,5 nanolitri progettate per iniettori di nanolitri. Tirare ciascuna pipetta su un estrattore per aghi in due fasi secondo le istruzioni del produttore per creare modelli a due aghi.
2. Rifinisci la punta delle sagome dell'ago tagliando circa 1-2 mm di vetro in eccesso con le microforbici. Misurare la dimensione approssimativa dell'apertura al microscopio con un vetrino di calibrazione per microscopio per isolare gli aghi con aperture di 30-40 μm.
3. Con l'ago posizionato a 30°, utilizzare una smussatrice per micropipette per creare un puntale con un'apertura di 30-40 μm e un angolo di smusso di 45°. Verificare la larghezza dell'apertura utilizzando la scala Vernier sul vetrino di calibrazione. Passare l'acqua e l'etanolo attraverso l'ago di vetro utilizzando una siringa con un attacco flessibile per lavare via i detriti e contrassegnare l'ago a intervalli regolari con un pennarello nero.
4. Posizionare gli aghi in una capsula di Petri coperta, precedentemente pulita con etanolo al 70%, e sterilizzare per 30 minuti in una cappa di biosicurezza sotto luce ultravioletta o UV.
5. Preparare il lentivirus a trasporto retrogrado altamente efficiente (HiRet) rimuovendo un volume adeguato dal congelatore immediatamente prima della procedura.
   NOTA: Un volume adeguato include la quantità necessaria per l'iniezione (1 μl per iniezione x numero di iniezioni) più una piccola quantità di volume extra per tenere conto delle perdite di pipettaggio e carico. Trasportare e conservare il virus sul ghiaccio quando non viene utilizzato.
6. Preparare l'iniettore collegandolo alla micropompa e inserendolo in un micromanipolatore con scala a corsoio.
7. Per preparare l'ago di vetro, caricare con cura un colorante colorato come l'olio rosso con una siringa dotata di un ago flessibile. Assicurarsi che non rimangano bolle nell'ago. Utilizzare una tecnica asettica quando si maneggia l'ago ed evitare di toccare la punta.
8. Inserire l'ago di vetro nell'iniettore, assicurandosi che l'ago sia posizionato correttamente nelle rondelle, che il tappo dell'iniettore sia avvitato saldamente e che l'ago dell'iniettore in acciaio sia esteso di circa 3/4 della lunghezza dell'ago di vetro. I virus possono essere caricati nell'ago in una fase successiva.

2. Anestesia e preparazione del sito chirurgico

1. Pesare l'animale su una bilancia digitale. Registrare il peso preoperatorio per determinare il volume di anestetico richiesto e per consentire il monitoraggio del peso dopo l'intervento chirurgico. In questo protocollo sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley femmine, circa 200-250 g.
2. Anestetizzare il ratto utilizzando l'inalazione di isoflurano o una soluzione iniettata di ketamina/xilazina (k/x). Qui, la ketamina viene iniettata per via intraperitoneale a 67 mg/kg e la xilazina a 6,7 mg/kg.
3. Confermare un piano anestetico appropriato pizzicando saldamente il piede. Se si verifica un ritiro riflessivo, attendere alcuni minuti prima di procedere.
   NOTA: Osservare anche i baffi, gli occhi e la frequenza respiratoria per segni di coscienza. Se i baffi si contraggono, l'occhio sbatte le palpebre quando viene toccato delicatamente o la respirazione è rapida e superficiale, attendere che il piano anestetico sia più profondo per procedere con il protocollo. Inoltre, monitora questi segni durante la laminectomia e l'intervento di iniezione. Se l'animale mostra un piano anestetico poco profondo, somministrare un richiamo di sola ketamina pari a 1/2 del dosaggio originale k/x.
4. Radere il ratto lungo la linea mediana dorsale dai fianchi all'angolo inferiore delle scapole. Tendere la pelle dell'animale per una rasatura più facile e precisa.
5. Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi.
6. Applicare un antisettico sull'area rasata per sterilizzare il sito. Per il primo scrub, immergere una garza sterile con una soluzione di iodio al 5% e rimuovere tutti i peli e i detriti. Seguire questo con un passaggio unidirezionale con una garza sterile imbevuta di etanolo al 70% in modo che nessuna area venga toccata due volte. Usa questa stessa tecnica alternando iodio e garza imbevuta di etanolo altre due volte.

3. Preparazione del campo chirurgico e degli strumenti

1. Preparare una serie di strumenti chirurgici autoclavati che includono bisturi, rongeur, pinze per denti di ratto, forbici a molla, emostatici, pinze curve a punta media e divaricatori o ganci ponderati srotolando l'involucro sterile per creare un campo sterile.
2. Aprire una confezione di guanti chirurgici sterili e posizionare l'involucro del guanto sterile sul tavolo. Utilizzarlo come campo sterile aggiuntivo per gli strumenti usati per evitare la contaminazione dell'involucro sterile.
3. Lascia cadere una lama di bisturi #10 sul campo sterile. Fissare la lama a un manico con gli emostatici. Posizionare la soluzione fisiologica sterile, la sutura cromica 4.0 catgut e i materiali per controllare il sanguinamento come un cauterizzante, una garza sterile, applicatori sterili con punta di cotone (per emorragie muscolari) o gelfoam o cera per ossa (per emorragie ossee) in un luogo accessibile.
4. Recupera l'animale e mettilo su un panno sterile. Metti una garza sotto la vescica per raccogliere l'urina. Sostenere l'area bersaglio con un asciugamano arrotolato sotto l'addome. Se disponibile, posizionare un termoforo chirurgico sotto il panno sterile, soprattutto per le procedure più lunghe.
   NOTA: La sterilità è importante durante la chirurgia di sopravvivenza. Tenere a portata di mano un flacone spray di etanolo al 70% per mantenere la sterilità delle mani guantate e utilizzare uno sterilizzatore a microsfere se la sterilità dello strumento è compromessa o tra un intervento chirurgico e l'altro.

4. Esposizione della colonna vertebrale e identificazione del sito della laminectomia

1. Identificare l'area in cui verrà praticata un'incisione cutanea premendo delicatamente le dita sull'ultima costola per localizzare il legname o la vertebra L1. Usando questo come punto di riferimento, fai un'incisione cutanea di 3-4 cm con un bisturi chirurgico #10 che termina appena sotto L1 per esporre il muscolo. Tenere la pelle tesa stendendola delicatamente e premendo con decisione con la lama del bisturi per garantire un'incisione pulita.
2. Tagliare e stendere il grasso superficiale con pinze e forbici, se necessario. (A seconda della vertebra bersaglio, può esserci o meno un grande cuscinetto adiposo superficiale al muscolo.)
3. Senti i processi spinosi con la parte piatta della lama del bisturi o con un dito. Spesso, l'area della linea mediana sarà delineata da una "V" di fascia bianca su entrambi i lati. Eseguire un piccolo taglio rostrale per lasciare spazio per afferrare saldamente un processo superiore con una pinza a dente di topo, quindi eseguire due tagli lunghi e profondi il più vicino possibile ai processi. Nel punto più profondo del taglio, la superficie dorsale delle vertebre può essere sentita con la lama del bisturi.
4. Tenere da parte i muscoli laterali con divaricatori o ganci appesantiti per migliorare la visibilità. Elimina i muscoli intorno ai processi con un bisturi, forbici a molla o rongeurs per determinare la forma delle loro teste.
   NOTA: Ricorda che il midollo spinale non si estende per l'intera lunghezza della colonna vertebrale, poiché il tessuto del midollo spinale smette di crescere prima nello sviluppo rispetto all'osso. Ciò significa che il livello spinale target può essere sotto una vertebra con un nome diverso.
5. Localizzare il toracico o T11 e i processi adiacenti T12 e T13.
   NOTA: L'assistenza nel mirare ai corretti livelli vertebrali può essere trovata in un atlante del midollo spinale di ratto e in studi precedenti che delineano punti di riferimento nel topo, che ha una struttura vertebrale molto simile6,33. Lasciare indisturbato un processo spinoso rostrale, come T9, per dare un punto di riferimento sulla linea mediana.

5. Esecuzione di una laminectomia

1. Una volta che l'area target è stata identificata correttamente, eseguire laminectomie degli aspetti dorsali di T11-T13. Allargare delicatamente le vertebre per rivelare i legamenti intervertebrali, che sono buoni siti per inserire i rongeur per il morso iniziale dell'osso. Tenere i rongeur in posizione semichiusa per aumentare il controllo fine.
2. Rimuovere i processi spinosi e l'aspetto dorsale delle vertebre prendendo piccoli morsi con i rongeur. Fare attenzione a non danneggiare il midollo spinale o disturbare la dura. Solleva leggermente con la pinza per denti di ratto per aiutare a tirare il midollo spinale lontano dalle vertebre e ridurre la tendenza a colpire il tessuto del midollo spinale.
3. Eliminare l'osso dalla linea mediana in modo che il vaso sanguigno della linea mediana possa essere osservato. Lascia una finestra che mostri chiaramente il tessuto del midollo spinale e sia priva di detriti.
4. Toccare delicatamente il midollo spinale con una pinza. Alcuni animali possono saltare di riflesso anche se il loro piano anestetico è profondo. Applicare alcune gocce di un agente paralizzante, come la lidocaina, direttamente sul midollo spinale per evitare salti durante la procedura di iniezione.
5. Fissare l'animale in un supporto spinale fissando una pinza stabilizzatrice ai processi spinosi rostrali e caudali alla finestra della laminectomia. Sollevare l'addome dell'animale utilizzando il supporto spinale per annullare l'effetto dei movimenti respiratori. Ciò aumenterà la stabilità dell'ago e garantirà l'appropriata profondità di iniezione.

6. Caricamento del virus e posizionamento dell'iniettore

1. Caricare il virus nell'iniettore pipettando circa 5 μl su un pezzo di parafilm e posizionando l'ago in modo che la punta si trovi all'interno della goccia.
2. Utilizzare la micropompa per prelevare fino a 4 μL di virus a una velocità di 20-100 nL/s.
3. Impostare il controller in modo da iniettare e rilasciare una piccola quantità di virus dall'ago per garantire che la punta dell'ago non sia bloccata. Rimuovere il virus in eccesso con una salvietta da laboratorio.
   NOTA: Una siringa Hamilton con ago in acciaio può essere utilizzata in alternativa alle pipette di vetro estratte.
4. Posizionare il micromanipolatore in modo che la squama del nonio sia visibile e posizionare l'ago sulla linea mediana del midollo spinale.
   NOTA: La linea mediana a volte può essere localizzata da un grande vaso sanguigno che scorre sulla superficie anteriore del midollo spinale. Tuttavia, questo può variare nei singoli ratti e il targeting della linea mediana dovrebbe essere confermato rispetto a un processo spinoso intatto.
5. Dirigere l'ago lateralmente di 0,8 mm utilizzando la scala Vernier sul micromanipolatore.
6. Abbassare l'ago sul midollo spinale fino a quando non rientra, ma non perfora, la dura dura. Con un rapido movimento rotatorio, forare la dura madre con l'ago fino a quando non è affondata a una profondità di 1,5 mm.

7. Iniezione del virus nel midollo spinale

1. Una volta posizionato l'ago, programmare l'iniettore in modo che inietti a una velocità di 400 nL/min. Verificare che il virus stia entrando nel midollo spinale osservando l'andamento del fronte del colorante. Non dovrebbero esserci perdite evidenti o rigonfiamenti del tessuto del midollo spinale. Se si osservano perdite, a volte queste possono essere alleviate riducendo la velocità di iniezione a 200 nL/min.
2. Una volta terminata l'iniezione, lasciare riposare l'ago nel midollo spinale per 2-5 minuti (a seconda del volume iniettato) per facilitare la diffusione del virus.
3. Estrarre lentamente l'ago e passare al sito di iniezione successivo. Iniettare 1 μL di virus in ciascuno dei 6 siti uniformemente distanziati a circa 1 mm di distanza lungo la lunghezza del tessuto spinale L1-L4. Lo stesso ago può essere utilizzato per ogni iniezione purché continui a funzionare correttamente.

8. Chiusura della ferita e cure post-operatorie

1. Rimuovere l'animale dal supporto spinale ed estrarre i divaricatori o i ganci utilizzati per allargare il muscolo laterale. Assicurarsi che la ferita sia libera da tutti i detriti prima di chiuderla.
2. Sutura il muscolo utilizzando una sutura cromica 4.0 catgut. Tagliare i fili di sutura vicino al nodo per ridurre la probabilità di irritazione interna della pelle.
3. Pinzare la pelle chiusa utilizzando clip per ferite da 9 mm. Per consentire una guarigione ottimale, allineare i bordi della pelle prima di pinzare.
4. Posiziona l'animale su un tappetino riscaldante a convezione d'acqua e monitora fino al risveglio.
5. Iniettare 5-10 ml di soluzione fisiologica sterile per via sottocutanea per reintegrare i liquidi e un antibiotico come la cefazolina per prevenire l'infezione. Quando l'animale è deambulante, rimettilo nella sua gabbia di casa e fornisci i primi analgesici. Monitora i ratti per qualsiasi segno di dolore e angoscia e trattali secondo la procedura approvata dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) per alleviare il dolore.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
#10 Lame per bisturi	Roboz	RS-9801-10	Da utilizzare con il bisturi.
Siringhe da 1 ml Becton	, Dickinson and Company	Per l'iniezione di IP anestetico, potenziali richiami anestetici e iniezioni di antibiotici.
Siringhe da 10 ml Becton	, Dickinson and Company	309604	Per l'iniezione di soluzione salina nell'animale, dopo l'intervento chirurgico.
Sutura cromica 4.0 Catgut	DemeTECH	NN374-16	Per rilegare il muscolo durante la chiusura.
48000 Smussatrice per micropipette	World Precision Instruments	32416	Utilizzato per smussare le punte dei tubi capillari di vetro tirati per formare aghi di vetro funzionali.
Soluzione di iodio al 5%	Purdue Products L.P.	L01020-08	Per l'uso nella sterilizzazione del sito chirurgico.
70% Etanolo	N/A	N/A	Per la sterilizzazione di aghi di vetro appena preparati, modelli animali durante la preparazione chirurgica e mani del chirurgo durante l'intervento chirurgico, nonché per tutti gli altri piccoli mantenuti di sterilità.
Anestetico (soluzione di ketamina/xilazina)	Zoetis	240048	Per mantenere l'animale nel corretto piano di coscienza durante l'intervento chirurgico.
Antibiotico (Cefazolina)	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	Da iniettare per via sottocutanea per prevenire l'infezione post-operatoria.
Sterilizzatore di perline	CellPoint	5-1450	Per sterilizzare a caldo gli strumenti chirurgici.
Bonewax	Fine Science Tools	19009-00	Per sigillare l'osso in caso di sanguinamento osseo.
Cauterizzatore	Fine Science Tools	18010-00	Per sigillare eventuali arterie o vene recise durante l'intervento chirurgico per prevenire un'eccessiva perdita di sangue.
Bilancia digitale	Okaus	REV.005	Per pesare l'animale durante la preparazione chirurgica.
Attacco flessibile dell'ago	World Precision Instruments	MF34G-5	Per la pulizia degli aghi di vetro e il caricamento di olio rosso negli aghi di vetro.
Gelfoam	Pfizer	H68079	Per sigillare l'osso in caso di sanguinamento osseo.
Tubi capillari in vetro	World Precision Instruments	4878	Per aghi in vetro tirati - dovrebbe essere progettato per iniettori di nanolitri.
Tagliacapelli	Oster	111038-060-000	Per liberare il sito chirurgico dai capelli.
Emostatici	Roboz	RS-7231	Per uso generale in chirurgia.
Kimwipes	Kimtech	34155	Per uso generale in chirurgia.
Pinze curve a punta media	Roboz	RS-5136	Per uso generale in chirurgia.
Micromanipolatore con scala a corsoio	Kanetec	N/A	Per un puntamento preciso durante l'intervento chirurgico.
Microforbici	Roboz	RS-5621	Per tagliare i fili di vetro dai tubi capillari di vetro appena tirati.
Microscopio con luce e scala a corsoio Oculare Leitz	Wetzlar	N/A	Utilizzato per visualizzare e misurare la smussatura di tubi capillari di vetro tirati in aghi di vetro funzionali.
Controller per pompe a microsiringa	World Precision Instruments	62403	Per controllare la velocità di iniezione.
Iniettore della testa della pompa Nanoliter 2000	World Precision Instruments	500150	Per caricare e iniettare virus in modo controllato.
Estrattore per aghi	Narishige	PC-100	Per riscaldare e separare i tubi capillari di vetro per formare aghi di vetro.
Unguento oftalamico	Dechra Veterinary Products	RAC 0119	Per proteggere gli occhi dell'animale durante l'intervento chirurgico.
Parafilm	Bemis	PM-996	Per aiutare a caricare il virus nel nanoiniettore.
Aghi PrecisionGlide (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Da utilizzare con le siringhe da 1 ml e 10 ml per consentire l'iniezione del modello animale.
Pinze per denti di ratto	Roboz	RS-5152	Per la presa di processi spinosi.
Red Oil	N/A	N/A	Per fornire un fronte per la visualizzazione del virus che entra nel tessuto durante l'iniezione.
Divaricatori	Roboz	RS-6510	Per tenere aperta la ferita chirurgica.
Rimadyl Compresse	Bio Serv	MP275-050	Per la gestione del dolore post-operatorio.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	Per rimuovere il muscolo dalla colonna vertebrale durante l'intervento chirurgico.
Manico a lama di bisturi	Roboz	RS-9843	Per affettare la pelle aperta e il cuscinetto adiposo di un modello animale durante l'intervento chirurgico.
Forbici	Roboz	RS-5980	Per uso generale in chirurgia.
Clip per ferite in acciaio inossidabile	CellPoint	201-1000	Per legare la pelle della ferita chirurgica durante la chiusura.
Pinze per la rimozione delle graffette	Kent Scientific	INS750347	Per rimuovere le graffette, se applicate in modo errato.
Panno sterile	Phenix Research Products	BP-989	Per fornire una superficie sterile per l'operazione.
Applicatori sterili con punta in cotone	Puritan	806-WC	Per assorbire il sangue nella ferita chirurgica mantenendo la sterilità.
Garza Sterile	Covidien	2146	Per pulire l'area chirurgica e gli strumenti chirurgici mantenendo la sterilità.
Soluzione salina sterile	Baxter Healthcare Corporation	281324	Per l'uso nella pulizia del sangue e per la sostituzione dei liquidi dopo l'intervento chirurgico.
Guanti chirurgici	N/A	N/A	Per l'uso da parte del chirurgo per mantenere il campo sterile durante l'intervento chirurgico.
Cuscinetto riscaldante chirurgico	N/A	N/A	Per mantenere la temperatura corporea del modello animale durante l'intervento chirurgico.
Microscopio operatorio	N/A	N/A	Per una migliore visualizzazione della ferita chirurgica.
Suturatrice chirurgica	Kent Scientific	INS750546	Per applicare le graffette.
Pompa dell'acqua per terapia del calore T / Pump	Gaymar	TP500C	Per pompare acqua calda nel cuscinetto riscaldante per convezione dell'acqua.
Cuscinetto riscaldante a convezione d'acqua	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	Per l'uso nell'area di recupero post-operatoria per mantenere la temperatura corporea dell'animale incosciente.
Ganci ponderati	N/A	N/A	Per tenere aperta la ferita chirurgica.

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