Un'iniezione di vettore virale nel midollo spinale del ratto per il tracciamento neuronale retrogrado

Abstract

Fonte: Keefe, K. M., et al. L'iniezione diretta di un vettore lentivirale evidenzia molteplici vie motorie nel midollo spinale del ratto. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra l'iniezione di un vettore virale di trasporto retrogrado (HiRet) altamente efficiente nel midollo spinale del ratto per tracciare i percorsi neuronali. Il virus ha glicoproteine per l'ingresso sinaptico e un gene codificante una proteina fluorescente. L'ago viene inserito nel midollo spinale e la sospensione virale viene somministrata a una velocità controllata. L'ago viene infine ritirato dopo aver concesso un tempo sufficiente per la diffusione virale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Prepara

1. gli aghi di vetro estratti per l'iniezione virale alcuni giorni prima dell'intervento utilizzando pipette capillari di vetro da 3,5 nanolitri progettate per iniettori di nanolitri. Tirare ciascuna pipetta su un estrattore per aghi in due fasi secondo le istruzioni del produttore per creare modelli a due aghi.
2. Rifinisci la punta delle sagome dell'ago tagliando circa 1-2 mm di vetro in eccesso con le microforbici. Misurare la dimensione approssimativa dell'apertur....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
#10 Lame per bisturi	Roboz	RS-9801-10	Da utilizzare con il bisturi.
Siringhe da 1 ml Becton	, Dickinson and Company	Per l'iniezione di IP anestetico, potenziali richiami anestetici e iniezioni di antibiotici.
Siringhe da 10 ml Becton	, Dickinson and Company	309604	Per l'iniezione di soluzione salina nell'animale, dopo l'intervento chirurgico.
Sutura cromica 4.0 Catgut	DemeTECH	NN374-16	Per rilegare il muscolo durante la chiusura.
48000 Smussatrice per micropipette	World Precision Instruments	32416	Utilizzato per smussare le punte dei tubi capillari di vetro tirati per formare aghi di vetro funzionali.
Soluzione di iodio al 5%	Purdue Products L.P.	L01020-08	Per l'uso nella sterilizzazione del sito chirurgico.
70% Etanolo	N/A	N/A	Per la sterilizzazione di aghi di vetro appena preparati, modelli animali durante la preparazione chirurgica e mani del chirurgo durante l'intervento chirurgico, nonché per tutti gli altri piccoli mantenuti di sterilità.
Anestetico (soluzione di ketamina/xilazina)	Zoetis	240048	Per mantenere l'animale nel corretto piano di coscienza durante l'intervento chirurgico.
Antibiotico (Cefazolina)	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	Da iniettare per via sottocutanea per prevenire l'infezione post-operatoria.
Sterilizzatore di perline	CellPoint	5-1450	Per sterilizzare a caldo gli strumenti chirurgici.
Bonewax	Fine Science Tools	19009-00	Per sigillare l'osso in caso di sanguinamento osseo.
Cauterizzatore	Fine Science Tools	18010-00	Per sigillare eventuali arterie o vene recise durante l'intervento chirurgico per prevenire un'eccessiva perdita di sangue.
Bilancia digitale	Okaus	REV.005	Per pesare l'animale durante la preparazione chirurgica.
Attacco flessibile dell'ago	World Precision Instruments	MF34G-5	Per la pulizia degli aghi di vetro e il caricamento di olio rosso negli aghi di vetro.
Gelfoam	Pfizer	H68079	Per sigillare l'osso in caso di sanguinamento osseo.
Tubi capillari in vetro	World Precision Instruments	4878	Per aghi in vetro tirati - dovrebbe essere progettato per iniettori di nanolitri.
Tagliacapelli	Oster	111038-060-000	Per liberare il sito chirurgico dai capelli.
Emostatici	Roboz	RS-7231	Per uso generale in chirurgia.
Kimwipes	Kimtech	34155	Per uso generale in chirurgia.
Pinze curve a punta media	Roboz	RS-5136	Per uso generale in chirurgia.
Micromanipolatore con scala a corsoio	Kanetec	N/A	Per un puntamento preciso durante l'intervento chirurgico.
Microforbici	Roboz	RS-5621	Per tagliare i fili di vetro dai tubi capillari di vetro appena tirati.
Microscopio con luce e scala a corsoio Oculare Leitz	Wetzlar	N/A	Utilizzato per visualizzare e misurare la smussatura di tubi capillari di vetro tirati in aghi di vetro funzionali.
Controller per pompe a microsiringa	World Precision Instruments	62403	Per controllare la velocità di iniezione.
Iniettore della testa della pompa Nanoliter 2000	World Precision Instruments	500150	Per caricare e iniettare virus in modo controllato.
Estrattore per aghi	Narishige	PC-100	Per riscaldare e separare i tubi capillari di vetro per formare aghi di vetro.
Unguento oftalamico	Dechra Veterinary Products	RAC 0119	Per proteggere gli occhi dell'animale durante l'intervento chirurgico.
Parafilm	Bemis	PM-996	Per aiutare a caricare il virus nel nanoiniettore.
Aghi PrecisionGlide (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Da utilizzare con le siringhe da 1 ml e 10 ml per consentire l'iniezione del modello animale.
Pinze per denti di ratto	Roboz	RS-5152	Per la presa di processi spinosi.
Red Oil	N/A	N/A	Per fornire un fronte per la visualizzazione del virus che entra nel tessuto durante l'iniezione.
Divaricatori	Roboz	RS-6510	Per tenere aperta la ferita chirurgica.
Rimadyl Compresse	Bio Serv	MP275-050	Per la gestione del dolore post-operatorio.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	Per rimuovere il muscolo dalla colonna vertebrale durante l'intervento chirurgico.
Manico a lama di bisturi	Roboz	RS-9843	Per affettare la pelle aperta e il cuscinetto adiposo di un modello animale durante l'intervento chirurgico.
Forbici	Roboz	RS-5980	Per uso generale in chirurgia.
Clip per ferite in acciaio inossidabile	CellPoint	201-1000	Per legare la pelle della ferita chirurgica durante la chiusura.
Pinze per la rimozione delle graffette	Kent Scientific	INS750347	Per rimuovere le graffette, se applicate in modo errato.
Panno sterile	Phenix Research Products	BP-989	Per fornire una superficie sterile per l'operazione.
Applicatori sterili con punta in cotone	Puritan	806-WC	Per assorbire il sangue nella ferita chirurgica mantenendo la sterilità.
Garza Sterile	Covidien	2146	Per pulire l'area chirurgica e gli strumenti chirurgici mantenendo la sterilità.
Soluzione salina sterile	Baxter Healthcare Corporation	281324	Per l'uso nella pulizia del sangue e per la sostituzione dei liquidi dopo l'intervento chirurgico.
Guanti chirurgici	N/A	N/A	Per l'uso da parte del chirurgo per mantenere il campo sterile durante l'intervento chirurgico.
Cuscinetto riscaldante chirurgico	N/A	N/A	Per mantenere la temperatura corporea del modello animale durante l'intervento chirurgico.
Microscopio operatorio	N/A	N/A	Per una migliore visualizzazione della ferita chirurgica.
Suturatrice chirurgica	Kent Scientific	INS750546	Per applicare le graffette.
Pompa dell'acqua per terapia del calore T / Pump	Gaymar	TP500C	Per pompare acqua calda nel cuscinetto riscaldante per convezione dell'acqua.
Cuscinetto riscaldante a convezione d'acqua	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	Per l'uso nell'area di recupero post-operatoria per mantenere la temperatura corporea dell'animale incosciente.
Ganci ponderati	N/A	N/A	Per tenere aperta la ferita chirurgica.

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