Ultrasuoni focalizzati ad alta intensità per bloccare i potenziali d'azione nervosi in un modello di ratto diabetico

Abstract

Fonte: Lee, Y. F., et al. Uno strumento a ultrasuoni per il blocco della conduzione nervosa in modelli di ratti diabetici. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra l'uso degli ultrasuoni focalizzati ad alta intensità (HIFU) per bloccare i potenziali d'azione dal nervo sciatico al muscolo gastrocnemio in un modello di ratto diabetico. Dopo aver erogato il fascio HIFU al nervo, una diminuzione del segnale muscolare conferma il potenziale di HIFU come terapia non invasiva per il sollievo dal dolore neuropatico diabetico.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Blocco della conduzione nervosa in vivo con il trasduttore HIFU (High-Intensity Focused Ultrasound)

NOTA: L'esperimento in vivo inizia alla settimana 5 dopo un'iniezione di 50 mg/kg di streptozotocina (STZ).

1. Esegui le procedure sugli animali prima di bloccare i potenziali d'azione muscolari composti (CMAP) con la sonicazione HIFU.
   1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici (bisturi, forbici, pinze e gancio di vetro) in autoclave prima dell'intervento.
   2. Anestetizzare i ratti con un'iniezione intraperitoneale di una miscela di tiletamina/zolazepam (40 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) o tramite inalazione dell'1,75% di isoflurano tramite vaporizzatore di isoflurano. Metti i ratti su un termoforo per mantenere la loro temperatura corporea.
   3. Posizionare i ratti per l'intervento chirurgico in decubito ventrale. Applicare l'unguento per gli occhi. Estendere la zampa del ratto e pizzicare la superficie plantare del piede con le unghie per accertare la profondità dell'anestesia. Se i ratti mostrano risposte di astinenza, applicare ulteriore anestesia.
   4. Rimuovi i peli dalla coscia e dalla parte bassa della schiena dei ratti con un tagliacapelli elettrico. Applicare iodio liquido con una garza pulita sul sito chirurgico e spostare circolarmente la garza verso l'esterno del sito chirurgico. Usa un tampone imbevuto di alcol per pulire lo iodio liquido con lo stesso movimento circolare. Questo esperimento viene eseguito sui siti chirurgici sinistro e destro. Ripetere la procedura nell'altro sito chirurgico quando si esegue la fase successiva della procedura.
   5. Usa una forbice chirurgica sterile o un bisturi per praticare un'incisione della pelle sulla parte dorsale della coscia. Usa le forbici chirurgiche smussate per separare con cura il tessuto sotto la pelle e fissare la pelle con ganci per la pelle. Il femore può essere visto all'interno dei muscoli.
   6. Usa le forbici per separare con cura i muscoli paralleli al femore fino a quando le fibre del nervo sciatico a metà coscia che sono incorporate nei muscoli sono visibili. Usa con attenzione un gancio di vetro per separare il nervo sciatico a metà coscia dai tessuti connettivi e dai muscoli circostanti.
2. Posizionare il nervo sciatico nella zona focale HIFU utilizzando un fissatore nervoso su misura (Figura 1 e Figura 2).
   NOTA: Il fissatore nervoso su misura è costituito da 3 componenti (Figura 2). Tutti i componenti sono realizzati in polimetilmetacrilato (PMMA) trasparente. La filettatura esterna della struttura superiore del componente I è alta 2,5 mm e M10XP0,7 (Figura 3A). Il pozzetto centrale è un foro di 4,0 mm di diametro attraverso il componente I. L'apertura inferiore del pozzo è sigillata da un foglio di nastro adesivo. Il diametro della fessura è di 1,2 mm e la distanza tra il piano centrale della fessura e la superficie superiore del componente I è di 3,1 mm. Il Componente II è costituito da un corpo principale, quattro gambe e la struttura inferiore (Figura 3B). La filettatura interna della struttura inferiore è alta 2,5 mm e M10XP0,7 per adattarsi alla filettatura esterna del componente I. Il diametro del foro centrale è lo stesso del pozzetto centrale del componente I. Le dimensioni del corpo principale sono di 32 mm di diametro e 5,4 mm di spessore. Quattro gambe sono dispiegate simmetricamente. Due gambe corte identiche sono progettate per l'allineamento e due gambe lunghe identiche funzionano per l'aggancio sul componente III. Il diametro esterno e l'altezza del componente III sono di 41 mm e 9,2 mm. La filettatura interna è M36XP1.0 e il foro passante ha un diametro di 27,5 mm (Figura 3C). Il cono è un cono cavo con un'apertura superiore di 84 mm di diametro e un'apertura inferiore di 27,5 mm di diametro. L'altezza è di 57,5 mm (Figura 4A).
   1. Prima dell'esperimento, immergi il fissatore nervoso acrilico su misura in una soluzione di candeggina per 30 - 60 minuti, seguito da un bagno in acqua sterile.
   2. Utilizzando un gancio di vetro, sollevare con cautela il nervo e inserirlo nella fessura del componente I.
   3. Avvitare il componente II al componente I. Riempire il pozzetto centrale del componente I con la soluzione di Ringer per la propagazione ultrasonica e la conservazione dei nervi.
   4. Avvitare il componente III al cono dell'alloggiamento HIFU. Agganciare il componente III con il componente II attraverso le quattro gambe del componente II.
      NOTA: Il centro geometrico dei tre componenti e il trasduttore sono allineati. La distanza tra il nervo e il trasduttore è uguale alla lunghezza focale, il che garantisce che il nervo si trovi all'interno della zona focale HIFU.
3. Inserisci un paio di aghi per agopuntura nell'origine del nervo sciatico e l'altro paio nel muscolo gastrocnemio. Collegare ogni coppia di aghi al sistema di acquisizione elettrofisiologica tramite un cavo coassiale elettrico (Figura 1).
   NOTA: Su un'estremità del cavo ci sono due clip a coccodrillo per agganciare due aghi separatamente e sull'altra estremità del cavo c'è un connettore Neill-Concelman (BNC) a baionetta per collegare il sistema. Le coppie di aghi per agopuntura funzionano come elettrodi stimolanti sul nervo sciatico e come elettrodi di registrazione sul muscolo gastrocnemio.
   1. Imposta la frequenza di campionamento e la larghezza di banda del sistema di acquisizione elettrofisiologica rispettivamente a 50 kHz e 70 Hz-3 kHz. Applicare uno stimolo sovramassimale con un'ampiezza dell'impulso di 0,1 ms agli elettrodi stimolatori all'origine del nervo sciatico.
   2. Registrare i CMAP dagli elettrodi di registrazione e amplificare i CMAP con l'amplificatore integrato nel sistema di acquisizione elettrofisiologica.
      NOTA: Utilizzare l'amplificatore integrato nel sistema di acquisizione elettrofisiologica per amplificare i segnali nervosi e registrare i CMAP dagli elettrodi di registrazione con il sistema di acquisizione elettrofisiologica.
4. Utilizzare un trasduttore HIFU commerciale da 2,68 MHz per sopprimere i CMAP nei ratti neuropatici diabetici.
   NOTA: Le specifiche del trasduttore sono descritte come segue: una ciotola sferica a elemento singolo con un diametro di apertura di 6 cm e una lunghezza focale di 5 cm e una zona focale ellissoidale di 4 mm di profondità e 0,8 mm di larghezza in campo libero.
   1. Immergi il cono sferico, il trasduttore HIFU e il coperchio del cono nel serbatoio riempito con acqua degassata. Inserire il trasduttore HIFU nel cono sferico e fissare il coperchio del cono all'apertura superiore del cono sferico con sei viti a testa (Figura 4B). Dopo che le bolle nel cono sferico sono state espulse naturalmente a causa della bassa densità delle bolle rispetto all'acqua, sigillare l'apertura anteriore del cono con un nastro trasparente di 0,03 mm di spessore. Avvitare il componente III sul cono sferico.
   2. Estrarre il trasduttore HIFU con il cono sferico e il componente III dal serbatoio dell'acqua degassata.
      NOTA: L'acqua ad osmosi inversa (RO) utilizzata nello studio è l'acqua purificata mediante il processo di osmosi inversa. L'acqua RO viene fatta bollire per espellere il gas. Dopo il raffreddamento, l'acqua degassata viene ottenuta in un serbatoio individuale sigillato.
5. Inserire con cura il componente I nello spazio tra il nervo e il muscolo e posizionare il nervo nello spazio del componente I. Eseguire i passaggi 1.2.3 e 1.2.4 per assicurarsi che il nervo si trovi all'interno della zona focale dell'HIFU (Figura 2A).
6. Collegare un generatore di funzioni e un amplificatore di potenza a radiofrequenza. Collegare l'amplificatore di potenza al trasduttore HIFU per generare il fascio HIFU. Impostare manualmente l'uscita di tensione del generatore di funzioni sul trasduttore HIFU tramite l'amplificatore di potenza. Spegnere manualmente il generatore di funzioni una volta scaduto il tempo di esposizione HIFU. Osservare l'ora utilizzando un timer.
   NOTA: L'intensità e l'energia del fascio HIFU utilizzato in questo studio sono rispettivamente 2.810 W/cm² e 84 J/mm².
7. Contemporaneamente, erogare lo stimolo tramite il sistema di acquisizione elettrofisiologica (passaggio 1.3) e il fascio HIFU tramite il sistema HIFU (passaggio 1.6) al nervo sciatico durante la registrazione dei CMAP. Aumentare gradualmente l'esposizione all'HIFU sul nervo sciatico da 3 s, 5 s a 8 s fino a quando non si osserva una diminuzione o un'inibizione dell'ampiezza dei CMAP.
   1. Registra i CMAP una volta al secondo durante la consegna del raggio HIFU. Dopo aver osservato la variazione dell'ampiezza dei CMAP, spegnere il sistema HIFU e fare clic manualmente sull'icona di registrazione sul software di acquisizione elettrofisiologica per registrare i CMAP ogni 2 minuti nei primi 10 minuti, ogni 5 minuti nei 30 minuti consecutivi e ogni 10 minuti nell'ultima fase fino a quando il tempo di registrazione raggiunge le 2 ore.
8. Separare i componenti II e III del fissatore nervoso (Figura 2) per rimuovere il trasduttore HIFU dal sito di incisione. Separare i componenti II e I per rilasciare il nervo sciatico protetto. Sutura il sito chirurgico del ratto diabetico con suture cromiche 4-0 di catgut dopo aver registrato i CMAP. Applicare iodio liquido sul sito chirurgico per prevenire l'infezione.
   1. Posiziona le gabbie sul termoforo e lascia che i ratti si riprendano nelle loro gabbie prima di riportarli alla struttura per animali. Somministrare ai ratti ibuprofene in acqua potabile per 3 giorni o un'iniezione intraperitoneale di buprenorfina (0,05 - 0,1 mg/kg).
9. Inserire elettrodi di stimolazione e registrazione nell'origine del nervo sciatico e dei muscoli gastrocnemio di ratti neuropatici diabetici anestetizzati come descritto nei passaggi 1.1.2 e 1.3 nei giorni 7, 14 e 28 dopo la sonicazione HIFU iniziale.

Risultati

Figura 1: La configurazione sperimentale per il blocco di conduzione nervosa in vivo con ultrasuoni focalizzati ad alta intensità (HIFU). (A) Un cono sferico acrilico su misura riempito con acqua degassata ad osm...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Streptozotocin	Sigma	85882
Biopac MP36 sistema di acquisizione	Biopac Systems, Inc.
Trasduttore HIFU	Sonic Concepts	H108
Generatore di funzioni	Agilent	33250A
Amplificatore di potenza	Elettronica e innovazione	1040L
Ratti	Biolasco taiwan	Sprague-Dawley
Puralube unguento veterinario	Dechra
Vaporizzatore di isoflurano	Parkland Scientific	V3000PS
Isoflurano	Attane