Trapianto di cellule precursori dell'interneurone nel cervello di un cucciolo di topo

Abstract

Fonte: Quattrocolo, G., et al. Trapianto omocronico di precursori di interneuroni in cervelli di topo postnatale precoce. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra il trapianto di cellule precursori degli interneuroni nel cervello di topo neonatale utilizzando un approccio omotopico o eterotopico. La procedura prevede l'ottenimento di un cucciolo ricevente anestetizzato, l'identificazione della regione cerebrale bersaglio e l'iniezione di una sospensione di cellule precursori derivate da un cucciolo donatore nella stessa fase di sviluppo. Dopo l'iniezione, il cucciolo viene trasferito su un cuscinetto riscaldante per il recupero, consentendo una successiva valutazione della sopravvivenza e della maturazione delle cellule del donatore.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Rimozione del cervello di topo P0-P2

1. Poco prima di iniziare la procedura, riempire diverse piastre di Petri con liquido cerebrospinale artificiale di saccarosio carbossigenato e raffreddato (sACSF). Riempire anche la/e provetta/e di raccolta con ~25 mL di sACSF.
2. Avvolgi un cucciolo postnatale da 0 a 2 (P0-P2) in un parafilm o in un guanto e mettilo ben coperto sotto il ghiaccio. Imposta un timer per 5 minuti e avvialo. Trascorso questo tempo, rimuovi il cucciolo e controlla che non risponda al pizzicamento della zampa posteriore.
3. Decapita il cucciolo e raccogli la testa in una capsula di Petri riempita di sACSF. Taglia la pelle lungo la linea mediana per esporre il cranio.
4. Individuare l'apertura nel cranio in corrispondenza del rombencefalo/midollo spinale e inserire un'estremità della pinza lungo la parte dorsale del cranio. Afferra delicatamente il cranio sulla linea mediana e "stacca" i pezzi lateralmente per esporre il cervello, facendo attenzione a non danneggiare il cervello.
5. Dopo aver rimosso le porzioni dorsale e laterale del cranio, utilizzare la pinza o la spatola per rimuovere delicatamente il cervello dal cranio scavando sotto la superficie ventrale del cervello, cercando di non danneggiare alcuna area. Metti il cervello in un'altra capsula di Petri riempita con sACSF carbossigenato. nota: Presentiamo due diverse strategie per sezionare l'ippocampo, lo striato e la corteccia. La prima strategia (passaggi 2.1-2.10) è utile per qualsiasi linea di topo, mentre la seconda strategia (passaggi 3.1-3.7) richiederebbe un topo reporter fluorescente per separare in modo netto lo striato dal globo pallido e da altre strutture cerebrali. Se lo striato non è desiderato, ignorare le parti specifiche dello striato delle due tecniche

2. Raccogli Striato, Ippocampo e Corteccia, Tecnica #1

1. Posizionare l'intero cervello sullo stampo della matrice di sezionamento, lato ventrale rivolto verso l'alto. Posizionare 1 lama di rasoio attraverso la parte più anteriore del cervello (attraverso il tratto olfattivo anteriore).
2. Inserisci un'altra lametta appena dietro la prima per generare una fetta di 0,5 mm e posiziona una lama di rasoio aggiuntiva posteriormente a questa.
3. Trasferisci queste fette in una capsula di Petri con sACSF carbossigenato e posiziona il resto del cervello in una piastra separata con sACSF. Trasferire le fette striatali in un cannocchiale da dissezione per visualizzare lo striato. Queste fette dovrebbero contenere ampie porzioni dello striato anteriore e mancare di ippocampo. Utilizzare un cannocchiale da dissezione fluorescente con Nkx2.1-Cre^+/-; Ai9^+/- fette per differenziare il debole segnale striatale tdTomato dal forte segnale tdTomato del globo pallido.
4. Con o senza fluorescenza, pizzicare lo striato da entrambi gli emisferi su tutte le sezioni e trasferire i pezzi striatali in una provetta da 50 ml correttamente etichettata con sACSF, conservare in ghiaccio.
5. Emisecta il cervello lungo la linea mediana usando una pinza o una lama di rasoio e posiziona l'emisfero in modo che la superficie mediale sia rivolta verso l'alto.
6. Rimuovere il tessuto cerebrale ventrale (talamo, gangli della base, ecc.) pizzicando questo tessuto con una pinza. Una volta completato, l'ippocampo (una struttura a forma di salsiccia che si estende lungo l'asse anteroposteriore lungo la corteccia dorsale) e il lato ventricolare della corteccia dovrebbero essere chiaramente visibili.
7. Per rimuovere l'ippocampo, inserire le punte della pinza davanti all'ippocampo anteriore e separare delicatamente l'ippocampo dalla corteccia muovendo la pinza posteriormente e pizzicando lungo il bordo ippocampale-corticale. Trasferire l'ippocampo isolato in una provetta da 50 ml correttamente etichettata con sACSF, conservare in ghiaccio.
8. Per sezionare la corteccia, posizionare la corteccia emisectata con il lato mediale rivolto verso il basso. Quindi usa la pinza per pizzicare le porzioni più dorsali, ventrali, anteriori e posteriori della corteccia per lasciare un pezzo quadrato di corteccia somatosensoriale mediale, ~ 2 mm x 2 mm. Capovolgere la corteccia in modo che il lato mediale sia rivolto verso l'alto e pulito da qualsiasi eccesso di tessuto non corticale (talamo, gangli della base, ecc.) sulla superficie mediale, se necessario. Trasferire il pezzo di corteccia in una provetta da 50 ml correttamente etichettata con sACSF, conservare in ghiaccio.
9. Ripeti la procedura con l'altro emisfero per raccogliere sia le regioni dell'ippocampo che quelle della corteccia.
10. Ripeti questa procedura per tutti i cuccioli, assicurandoti di sostituire il sACSF nelle piastre di Petri tra i cuccioli per assicurarti che il sACSF rimanga freddo e fresco.

3. Raccogli striato, ippocampo e corteccia, tecnica #2

1. Posiziona il cervello con il lato ventrale rivolto verso il basso in una capsula di Petri rivestita di silgarda contenente sACSF e fissalo attraverso il cervelletto e la corteccia anteriore o i bulbi olfattivi.
2. Partendo da un emisfero, usa una pinza curva per separare delicatamente la corteccia posteriore dall'ippocampo sottostante e da altri tessuti. Appoggiare delicatamente la corteccia sbucciata sulla capsula di Petri. Ripetere per l'altro emisfero. L'ippocampo e lo striato dovrebbero essere chiaramente visibili nel cervello esposto.
3. Usa una pinza per pizzicare un ippocampo sulla linea mediana e staccare l'ippocampo lateralmente per rimuoverlo. Mettere nella fiala di raccolta sul ghiaccio e ripetere con l'altro ippocampo.
4. Per lo striato, raschiare delicatamente i bordi dello striato per allentarlo dal tessuto circostante. Quindi, rimuovere lo striato pizzicandolo da sotto e aggiungerlo alla provetta di raccolta con ghiaccio. Ripetere per l'altro striato.
5. Le sezioni corticali possono essere raccolte come descritto nel passaggio 2.8.
6. Se si utilizza una linea di topo reporter transgenico (ad esempio, Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP, ecc.), trasferire lo striato in una piastra di Petri con sACSF e visualizzare sotto un cannocchiale da dissezione fluorescente. Utilizzare una pinza per rimuovere qualsiasi tessuto non striatale dallo striato (in Nkx2.1-Cre; I topi Ai9 rimuovono tutto il tessuto "luminoso", poiché il globus pallidus ha un'eminenza gangliare mediale molto più elevata o una densità cellulare tdTomato+ derivata da MGE rispetto allo striato). Ripetere per tutto lo striato.
7. Ripeti questa procedura per tutti i cuccioli, assicurandoti di sostituire il sACSF nelle piastre di Petri tra i cuccioli per assicurarti che il sACSF rimanga freddo e fresco.

4. Generazione di dissociazioni di singole cellule

1. Al termine della dissezione, preparare una soluzione di pronasi da 1 mg/mL pesando 10 mg di pronasi e sciogliendola in 10 mL di sACSF carbossigenato.
2. Trasferire il tessuto dai flaconcini di raccolta da 50 mL a provette a fondo tondo da 5 mL contenenti 2 mL di soluzione di pronasi-sACSF. Incubare il tessuto per 20 minuti a temperatura ambiente, agitando/muovendo la provetta 3-4 volte con il dito durante l'incubazione per mescolare i campioni.
3. Durante questa incubazione, preparare la soluzione di ricostituzione: 1% di siero fetale bovino (FBS, 100 μL) + DNAsi (1 μL di DNAsi stock 1:10.000) in 10 mL di sACSF carbossigenato.
4. Dopo i 20 minuti, rimuovere con cautela la soluzione di pronasi per non disturbare il tessuto sul fondo e sostituirla con 1-2 ml di soluzione di ricostituzione (il volume totale dipende dalla quantità iniziale di tessuto).
5. Dissociare meccanicamente il tessuto triturando il tessuto con le pipette Pasteur lucidate a fuoco precedentemente preparate. Iniziando con la pipetta a foro largo (~600 μm), aspirare ed espellere la soluzione tissutale almeno dieci volte per rompere il tessuto. Non introdurre bolle nella soluzione. Ripetere questa procedura per la pipetta di diametro medio e la pipetta di foro piccolo. La soluzione deve essere torbida e nessun pezzo di tessuto chiaro deve essere visibile nelle provette di raccolta.
6. Pipettare la soluzione di lisato cellulare attraverso un filtro da 50 μm in provette coniche da 5 mL per rimuovere eventuali grumi di cellule. Procedere con queste soluzioni a singola cellula alla citometria a flusso (o potenzialmente direttamente alla conta delle cellule se non è necessario lo smistamento).

5. Preparazione di soluzioni cellulari purificate con smistamento cellulare attivato da fluorescenza (FACS) per

1. il trapianto Dopo aver ricevuto le soluzioni cellulari dal citometro a flusso, trasferire la soluzione in una (o più) provette coniche da 1,5 ml e centrifugare le cellule a 500 g per 5 minuti a 4^oC. Dopo la centrifugazione, rimuovere il terreno in modo che rimangano ~20-40 μl nella provetta. Ricostituire le cellule in questo terreno rimanente (e combinare la soluzione se sono necessarie più provette).
2. Su un piccolo pezzo di parafilm, mescolare insieme 2 μL di soluzione cellulare + 8 μL di sACSF + 10 μL di colorante blu di tripano. Pipettare 10 μL in un emocitometro con coperchio del vetrino.
3. Contare il numero di cellule vive in ciascuna delle griglie quadrate 4 x 4 negli angoli dell'emocitometro utilizzando un contatore manuale standard da laboratorio (le cellule morte saranno blu a causa del colorante) e fare la media di questi 4 conteggi. Moltiplica questo numero per 100 per determinare il numero di cellule per μL.
4. Se necessario, regolare il volume in modo che le cellule siano a una concentrazione di 10.000-30.000 cellule/μL in soluzione di ricostituzione. La concentrazione finale dipende dalla quantità totale di cellule e dal numero desiderato di trapianti. Mantenere le cellule sul ghiaccio per il trapianto

6. Trapiantamento in cuccioli di P0-2 WT

1. Avvolgi un cucciolo di tipo selvatico (WT) in un parafilm o in un guanto e posizionalo ben coperto sotto il ghiaccio. Imposta un timer per 5 minuti e avvialo. Trascorso questo tempo, rimuovi il cucciolo e controlla che non risponda al pizzicamento della zampa posteriore.
2. Mentre il cucciolo è in ghiaccio, mescolare la soluzione cellulare pipettandola più volte per assicurarsi che la sospensione cellulare sia ben miscelata prima del caricamento (mescolare le cellule prima di caricare la micropipetta per ogni iniezione). Quindi svuotare la micropipetta dell'olio minerale e riempirla completamente con la sospensione cellulare.
3. Posiziona il cucciolo anestetizzato sulla capsula di Petri con la testa sdraiata sullo stucco adesivo in modo che la parte superiore della testa sia relativamente piatta. Posiziona il nastro con il foro diamantato sulla testa del cucciolo, tirandolo in tensione per assicurarti che la pelle sia tesa e la testa sia ferma, ma che il topo sia a suo agio e respiri bene. La lambda dovrebbe essere visibile attraverso il foro del diamante.
4. Spostare il cucciolo fissato sotto il Nanoject e abbassare la micropipetta in modo che la punta della micropipetta sia posizionata direttamente sopra lambda. Registra le coordinate x-y sul manipolatore.
5. Regolare le manopole del manipolatore per spostare la micropipetta alle coordinate desiderate lungo l'asse mediolaterale e quello anteroposteriore della testa: corteccia somatosensoriale primaria o corteccia S1 → 1,0 mm anteriore e 1,0 mm laterale, ippocampo → 0,75-1,0 mm anteriore e 1,0-1,2 mm laterale, striato → 2,0-2,2 mm anteriore e 1,5 mm laterale. Le coordinate possono essere regolate leggermente per compensare l'età del cucciolo (ad esempio, P0 vs. P2) o il ceppo dei topi (ad esempio, i topi CD1 sono più grandi di C57/B6 a P2).
6. Abbassare la micropipetta fino a formare una piccola concavità sulla pelle. Quindi ruotare la manopola del manipolatore dell'asse z con decisione ma delicatamente per guidare la micropipetta attraverso la pelle e il cranio per entrare nel cervello. Quando la micropipetta entra nel cervello, la pressione sul cranio verrà rilasciata e la concavità scomparirà.
7. Ritrarre leggermente la micropipetta fino a quando la punta non è circondata da un cono di pelle, a forma di tenda. Leggere le coordinate lungo gli assi z: questo sarà il punto zero dell'asse z.
8. Abbassare la micropipetta alla profondità desiderata: Cortex → 0,75-1,0 mm, Hippocampus → 1,2-1,5 mm, Striato → 2,0-2,5 mm. La profondità può essere regolata leggermente per compensare l'età o lo sforzo del cucciolo.
9. Iniettare la sospensione cellulare utilizzando il programma Nanoject III descritto sopra. Al termine del programma di iniezione, attendere 15-20 s prima di ritrarre lentamente la micropipetta per ridurre al minimo la fuoriuscita di soluzione dal sito di iniezione.
10. Se si eseguono iniezioni bilaterali, azzerare nuovamente la micropipetta sopra lambda e spostarsi alle coordinate corrette nell'altro emisfero. In alternativa, si possono effettuare due iniezioni nella corteccia dello stesso emisfero spostando la micropipetta di 1 mm anteriormente alla prima iniezione.
11. Una volta completato il trapianto, rimuovere il nastro adesivo e trasferire il cucciolo sul termoforo. Se necessario, tagga il cucciolo tagliando la coda o le dita dei piedi. Una volta che il cucciolo ha riacquistato un colore rosso e si muove, rimettilo nella gabbia con la madre.

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