Trasfezione mediata da elettroporazione dei gangli della radice dorsale di topo per promuovere la rigenerazione sensoriale degli assoni

Abstract

Fonte: Li, Q. et al. Indagine sulla rigenerazione degli assoni dei mammiferi: elettroporazione in vivo del ganglio della radice dorsale del topo adulto. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video dimostra la trasfezione mediata dall'elettroporazione di neuroni DRG di topo per studiare la rigenerazione degli assoni. Delinea i passaggi per la consegna di costrutti di acido nucleico ai neuroni DRG, l'induzione di lesioni al nervo sciatico e la valutazione della rigenerazione assonale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Iniezione del ganglio della radice dorsale (DRG)
   1. Iniettare una soluzione anestetica (diluire l'avertina in soluzione salina sterile a una concentrazione finale di 20 mg/mL, con avertin 200 mg/kg di peso corporeo) per via intraperitoneale per mantenere l'anestesia prima dell'iniezione di DRG.
   2. Caricare i plasmidi dell'acido desossiribonucleico (DNA) o gli oligo dell'acido ribonucleico (RNA) (1 μL per DRG) nella pipetta capillare di vetro.
   3. Inserire con cautela la punta della pipetta capillare in vetro nel DRG.
   4. Iniettare gradualmente 1,0 μL di soluzione di plasmidi di DNA o oligo di RNA nel DRG utilizzando i sistemi di dispensazione per microiniezione intracellulare (30 psi, 8 ms).
      NOTA: La durata dell'iniezione non deve essere inferiore a 5 minuti.
2. Electroporation
   1. Drop soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) sulle punte degli elettrodi.
   2. Pulisci l'emorragia con una garza di cotone quadrata sterilizzata.
   3. Pizzicare delicatamente il DRG target con gli elettrodi e applicare 5 impulsi elettrici quadrati con il sistema di elettroporazione.
   4. Chiudere gli strati muscolari e cutanei con suture di nylon 5-0, rispettivamente.
   5. Posizionare il topo su una coperta riscaldata (35,0 °C) sotto stretta attenzione fino a quando non ha completamente riacquistato conoscenza sufficiente per mantenere la decubito sternale. Rimetti il topo nella gabbia di casa dopo che si è completamente ripreso dall'anestesia.
      NOTA: Ci vogliono circa 60 minuti perché il topo si riprenda completamente dall'anestesia sulla coperta a 37 °C. Sciogliere una pillola (200 mg) di ibuprofene in 1.000 ml di acqua (0,2 mg/ml) per l'alimentazione quotidiana per alleviare il dolore post-operatorio.
3. Schiacciamento del nervo sciatico
   Due
   1. o tre giorni (a seconda del disegno sperimentale) dopo l'elettroporazione DRG, anestetizzare il topo per via intraperitoneale con la soluzione anestetica (con avvertina 400 mg/kg di peso corporeo).
   2. Fissa i quattro arti del topo sulla bacheca.
   3. Praticare un'incisione di 1 cm, 0,5 cm sul lato sinistro lungo la linea mediana. Tagliare longitudinalmente i muscoli, come il muscolo grande gluteo e il muscolo piriforme. Esporre il segmento del nervo sciatico tra il grande forame sciatico e l'incisura sciatica.
   4. Schiacciare il nervo con una pinza per microchirurgia per 12 s e contrassegnare il sito di schiacciamento con una sutura epineurale in nylon 10-0. Fai un nodo sulla membrana durale per segnare il sito di schiacciamento.
   5. Chiudere gli strati muscolari e cutanei con sutura di nylon 5-0.
   6. Posizionare il topo su una coperta riscaldata (35,0 °C) con molta attenzione fino a quando non ha completamente riacquistato conoscenza sufficiente per mantenere la decubito sternale. Rimetti il topo nella gabbia di casa dopo che si è completamente ripreso dall'anestesia.
      NOTA: Il mouse impiega circa 60 minuti per riprendersi completamente dall'anestesia sulla coperta a 37 °C. Sciogliere una pillola (200 mg) di ibuprofene in 1.000 ml di acqua (0,2 mg/ml) per l'alimentazione quotidiana per alleviare il dolore post-operatorio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ECM 830 Sistema di elettroporazione a onda quadra	BTX Harvard Apparatus	45-0052	Per elettroporazione in vivo
Pinzette elettrodi	BTX Harvard Apparatus	45-0524	Per elettroporazione in vivo, 1 mm piatto
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	Sistemi di erogazione di microiniezione intracellulare
Capillari in vetro borosilicato	World Precision Instruments, Inc.
Microscopio per dissezione stereo	Leica	M80
Pinze per microchirurgia	FST di DUMONT, Svizzera	11255-20	Solo per schiacciamento del nervo sciatico
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, nastro da parete standard
Fisherbrand		15-901-30	Per fissare il mouse sulla bacheca
2, 2, 2-Tribromoetanolo (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin soluzione madre
2-metil-2-butanolo	Sigma-Aldrich	152463	Avertin soluzione madre
siRNA Fluorescente Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC003	SiRNA non bersaglio con
microRNA a fluorescenza Controllo della trasfezione mimica con Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	MicroRNA non bersaglio con fluorescenza
Kit di preparazione dei plasmidi	Invitrogen Purelink	K210016	Preparazione di plasmidi codificanti GFP
Digiuno verde veloce	Millipore-Sigma	F7252	Per una migliore visualizzazione del contorno DRG durante l'iniezione
Ketamina	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Induzione dell'anestesia
Xilazina	AnaSed	NDC 59399-110-20	Induzione dell'anestesia
Paracetamolo	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	Sollievo dal dolore post-chirurgico

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