Somministrazione intratecale di virus in un modello murino per il trattamento delle malattie del sistema nervoso centrale

Abstract

Fonte: Li, D., et al. Iniezione intratecale diretta di virus adeno-associati ricombinanti in topi adulti. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra la procedura per l'iniezione intratecale di virus adeno-associati (AAV) nel liquido cerebrospinale (CSF) di un topo sveglio, coprendo la preparazione della siringa, l'allineamento spinale e l'inserimento preciso dell'ago. Questo metodo convalida la somministrazione genica mirata, supportando il suo potenziale per le terapie del SNC.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione della soluzione madre di lidocaina cloridrato al 20%

1. Pesare 2 g di lidocaina cloridrato. Aggiungere 5-6 ml di acqua sterile e agitare delicatamente. Aumentare il volume a 10 ml con acqua sterile.
2. 1.2 Filtrare la soluzione madre attraverso filtri da 0,2 micron. Aliquotare la soluzione madre, 1 mL per provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, e sigillarla con una pellicola sigillante. Conservare a 4 °C.

2. Somministrazione intratecale diretta di AAV nei topi svegli

1. Pulire l'area di lavoro utilizzando una garza sterile con etanolo al 70% e preparare le forniture necessarie.
2. Preparare 100 μL di complesso AAVrh.10/1% lidocaina cloridrato aggiungendo 95 μL di soluzione madre di rAAVrh10 (5 x 10¹² copie del genoma/mL) in una provetta sterile da microcentrifuga da 200 μL e aggiungere 5 μL di soluzione madre di lidocaina cloridrato al 20%. Mescolare bene pipettando su e giù. Quindi, conservare la soluzione virale in ghiaccio (4 °C).
   NOTA: verranno utilizzati 8 μl per topo.
3. Preparazione della siringa con soluzione iniettabile AAV
   1. Assemblare una siringa Hamilton da 25 μL con un ago da 27 G e allineare la punta smussata dell'ago con la scala volumetrica sulla siringa.
   2. Aspirare delicatamente 8 μl con 4 x 10 copie del genoma della soluzione virale nella siringa. Assicurati di rimuovere le bolle d'aria.
4. Preparazione del topo
   NOTA: Questo studio ha utilizzato topi FVB/NJ maschi o femmine (30-70 giorni). L'iniezione IT è stata eseguita nel cofano.
   1. Sterilizza l'area di lavoro in una cappa con etanolo al 70%. Metti il topo sveglio (maschio o femmina, 30-70 giorni, peso 13-20 g) su una zappa in posizione prona nel cappuccio. Copri la parte superiore del corpo con una garza sterile per calmare il topo ed evitare di essere morso.
   2. Fissare l'animale afferrandolo in modo appropriato e saldo alla cintura pelvica con il pollice da un lato e l'indice/medio dall'altro. Tenere tesa la pelle tra i cingoli pelvici bilaterali con il pollice e l'indice. Tenere delicatamente la parte superiore del corpo dell'animale con il palmo della mano.
   3. Radere il pelo sul dorso tra i cingoli pelvici bilaterali, quindi sterilizzare la superficie cutanea con uno scrub a base di ioduro ed etanolo al 70%.
5. Iniezione intratecale
   1. Senti lo spazio intervertebrale lungo la linea mediana tra i cingoli pelvici bilaterali con un pollice o l'indice dell'altra mano e premi una rientranza con un'unghia per indicare lo spazio intervertebrale L5-L6 (individua il sito di iniezione).
   2. Ruota leggermente e delicatamente la base della coda per indicare la linea mediana della colonna vertebrale. Regolare lo smusso dell'ago verso la testa dell'animale prima dell'iniezione.
   3. Assicurati che gli animali siano fissati saldamente e allinea l'ago lungo la linea mediana della colonna vertebrale.
   4. Inserire l'ago delicatamente e verticalmente (o inclinarlo leggermente di 70-80°) nell'intersezione della rientranza, mantenendo la siringa su un piano sagittale centrale. Ridurre lentamente l'angolo a circa 30° quando collega l'osso, quindi infilare l'ago nello spazio intervertebrale.
      NOTA: Un evidente movimento improvviso della coda è un segno di ingresso riuscito nello spazio intradurale. Una volta che l'ago entra nello spazio intervertebrale, la punta dell'ago si sentirà saldamente bloccata. L'ago da 27 G utilizzato in questo studio è adatto per la somministrazione di IT nei topi ma non nei ratti.
   5. Iniettare la soluzione vettoriale. Avviare il timer e iniettare 8 μL della soluzione vettoriale alla velocità di 1 μL/4 s. Conservare l'ago circa 1 minuto dopo aver terminato l'erogazione. Estrarre l'ago con una rotazione delicata per evitare perdite.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
FVB/NJ topi	Charles River Laboratories China
Lidocaine cloridrato monoidrato	HEOWNS	73-78-9
AAV	Viral Vector Core del Centro di Terapia Genica dell'Università di Massachusetts Medical School
25μL Hamilton siringa/27-30g ago	GASTIGHT	1702
70% etanolo	WEN ZHI
Garza	Wei AN	5171112	8cm*10cm*12cm