Isolamento di cellule primarie trofoblasto mouse e Invasion Assay trofoblasto

Sommario

In questo protocollo, si descrive la dissezione placentae dal mouse sulla gravidanza D10.5, seguito da isolamento di cellule trofoblastiche mediante gradiente di Percoll. Abbiamo poi dimostrare l'utilizzo delle cellule isolate in un saggio di invasione Matrigel.

Abstract

La placenta è responsabile per il trasporto di sostanze nutritive, gas e fattori di crescita per il feto, nonché l'eliminazione dei rifiuti. Così, difetti di sviluppo della placenta hanno importanti conseguenze per il feto e la madre, e sono una delle principali cause di mortalità embrionale. Il tipo cellulare principale della porzione fetale della placenta è trofoblasto. Primarie trofoblasti placentari topo sono un utile strumento per studiare normale e anormale sviluppo placentare, ea differenza linee cellulari, possono essere isolati e utilizzati per studiare trofoblasto in determinate fasi della gravidanza. Inoltre, colture primarie di trofoblasto di topi transgenici possono essere utilizzati per studiare il ruolo di particolari geni in cellule placentari. Il protocollo qui presentato è basato sulla descrizione da Thordarson et al. ^1, in cui viene utilizzato un gradiente Percoll per ottenere una popolazione di cellule relativamente puro trofoblasto da placente mouse isolato. È simile a utilizzare il più ampiamentemetodi per l'uomo d ^2-3 isolamento cellulare trofoblasto. Purezza può essere valutata mediante colorazione immunocitochimica delle cellule isolate per citocheratina 7 ^4. Qui, le cellule isolate vengono quindi analizzati utilizzando un saggio di invasione matrigel a valutare invasività trofoblasto in vitro ^5-6. Le cellule invase vengono analizzati mediante immunocitochimica e tinto per il conteggio.

Protocollo

1. Dissezione della placenta del mouse

1. Impostare coppie di accoppiamento di topi.
2. In ciascuno dei giorni seguenti, verificare la presenza di una spina copulatore. Il giorno in cui viene rilevato un tappo è considerato 0,5 giorni post-coito (DPC) ^7.
3. Placente possono essere raccolte nella fase desiderata della gravidanza, con una dissezione pulita dell'inizio placenta possibile con lo sviluppo della placenta maturo d 10,5. In questo studio dimostriamo 14,5 dpc. Ai volumi dati, 40-60 placente da 10,5 dpc, e 10-20 su placente 14,5 dpc produrrà un ben visibile strato di cellule del trofoblasto.
4. Eutanasia....

Discussione

In questo video, dimostriamo l'isolamento di cellule del trofoblasto della placenta mouse. Abbiamo poi mostrano un saggio in vitro per l'invasione del trofoblasto. Utilizzando questa procedura, una gran parte, ma non completamente, popolazione pura di cellule trofoblastiche può essere ottenuta. Se la purezza è necessario un ulteriore, separazione magnetica tallone o citometria di flusso potrebbe essere eseguita, come è stato descritto per primarie cellule trofoblastiche umane. La corretta lunghezza del passo col.......