Iniezione sottoretinica di vettori virali nell'epitelio pigmentato retinico in un modello murino

In questo articolo

Abstract

Fonte: Park, S. W., et al. Approccio limbare-Iniezione sottoretinica di vettori virali per la terapia genica nell'epitelio pigmentato retinico di topi. J. Vis. Exp. (2015)

Il video descrive il metodo per l'iniezione sottoretinica di vettori virali nell'epitelio pigmentato retinico (RPE) in un modello murino. Descrive in dettaglio la procedura, dall'anestesia e dalla preparazione degli occhi alla consegna precisa del vettore lentivirale, garantendo l'integrazione e l'espressione genica nell'EPR.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione del kit per l'iniezione e dei vettori virali

Preparare la siringa da microlitro dotata di un ago smussato da 33 G sterilizzato con gas di ossido di etilene. Diluire i vettori virali in PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) per ottenere un titolo adeguato nella microprovetta (ad esempio, 1 x 10⁶ TU/μl). Sciacquare più volte la siringa con vettori virali per rimuovere eventuali spazi morti nella siringa.

2. Iniezione sottoretinica di vettori virali

Anestetizzare i topi adulti (cioè di età compresa tra 6 e 8 settimane) con un'iniezione intraperitoneale della miscela di tiletamina e zolazepam (1:1, 2,25 mg/kg di peso corporeo) e xilazina cloridrato (0,7 mg/kg di peso corporeo) o un regime di anestesia alternativo adatto.
Dilatare le pupille con un collirio di fenilefrina 0,5% e tropicamide 0,5%.
Preparare la siringa da microlitro caricandola con 1,5 - 2 μl di vettori virali.
Aprire la palpebra e sporgere l'occhio per esporre l'equatore per una comoda iniezione. Mettilo a fuoco sotto il microscopio operatorio. Mantenere la posizione sporgente dell'occhio fino al termine dell'iniezione, altrimenti può verificarsi lo spostamento dell'ago durante l'iniezione. Per tenere saldamente il bulbo oculare, posizionare le dita al di fuori del bordo orbitale.
Applicare una goccia di soluzione viscoelastica oftalmica sulla superficie corneale.
Posiziona un piccolo vetrino di copertura rotondo sulla parte superiore della cornea per visualizzare la retina.
Praticare un piccolo foro nella parte leggermente posteriore del limbus utilizzando un ago sterile da 30 G 1/2 per un'ulteriore iniezione sottoretinica. Per comodità, renda il foro inferiore per l'occhio destro e superiore per l'occhio sinistro.
NOTA: Se il foro è praticato a livello temporale o nasale, è difficile essere coperti dalla palpebra dopo l'iniezione. La puntura iniziale deve essere effettuata leggermente posteriormente al limbus per evitare i vasi limbari che corrono lungo il limbus e possono essere facilmente riconosciuti. Fare attenzione a non colpire la lente con un ago durante la puntura iniziale. Non inserire l'intero smusso dell'ago per evitare la perforazione dell'obiettivo.
Posizionare l'ago smussato da 33 G della siringa da microlitro attraverso il foro pre-perforato e avvicinare l'ago nello spazio sottoretinico fino a quando non si avverte una leggera resistenza.
NOTA: Per l'iniezione sottoretinica, il miglior angolo di approccio dell'ago è di circa 45 gradi contro il piano dell'iride e l'ago smussato deve essere spinto posteriormente verso l'area peripapillare. Il quadrato tratteggiato indica il percorso suggerito dell'ago attraverso la cavità vitreale per l'iniezione sottoretinica nella Figura 1.
NOTA: Non si avverte alcuna resistenza durante la perforazione (o il passaggio) degli strati retinici in quanto sono molto morbidi. Pertanto, la prima sensazione di lieve resistenza indica che l'ago ha già toccato lo strato di RPE (epitelio pigmentato retinico) e l'inserimento dell'ago deve essere interrotto. Fare attenzione a non penetrare nel tessuto sclerale con una pressione eccessiva perché l'ago deve essere posizionato nel potenziale spazio sottoretinico. Se l'ago perfora il tessuto sclerale con una forza eccessiva, entra negli spazi orbitari extraoculari senza resistenza. (Questo passaggio è fondamentale)
Iniettare delicatamente i vettori virali (ad es. 1 x 10⁶TU/μl) nello spazio sottoretinico senza tremore per evitare danni indesiderati ai tessuti. Quindi, estrarre delicatamente l'ago. Tenere saldamente il bulbo oculare durante l'iniezione, come descritto al punto 2.4.
Osservare la formazione di bolle sottoretiniche dopo l'iniezione al microscopio operatorio per assicurarsi che non vi siano sanguinamenti retinici.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Figura 1. Schema schematico dell'iniezione sottoretinica. Sezione trasversale colorata H&E (colorazione con ematossilina ed eosina) dell'occhio del topo che raffigura le strutture con un percorso dell'ago per l'iniezione sottoretin...