Una tecnica di spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier per studiare l'autoassemblaggio dei peptidi

Abstract

Fonte: Neves, R., et al. Sintesi e caratterizzazione di peptidi autoassemblanti modificati con 1,2-ditiolano. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video dimostra l'auto-assemblaggio di peptidi amiloidi in una struttura supramolecolare ricca di fogli beta utilizzando la spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier. Un raggio infrarosso viene fatto passare attraverso un cristallo con un alto indice di rifrazione e viene registrato l'assorbimento di energia attraverso l'interfaccia del cristallo e del campione. Le strutture secondarie delle proteine del campione vengono identificate analizzando i loro picchi di assorbimento caratteristici in regioni specifiche dello spettro infrarosso, il che aiuta a identificare la formazione dell'assemblaggio supramolecolare.

Protocollo

1. Caratterizzazione di strutture di autoassemblaggio supramolecolari

1. Formazione di fibre amiloidi
   1. Per preparare una soluzione autoassemblante, pesare 1 mg di polvere di peptidi utilizzando una bilancia analitica. Sciogliere in una miscela (pH 7,5) il 20% di acetonitrile e 10 mM (4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, fino a una concentrazione finale di 1 mg/mL di miscela di assemblaggio peptidico. Agitare la soluzione di montaggio e lasciarla assemblare a temperatura ambiente.
2. Caratterizzazione spettroscopica di fibre amiloidi
   1. Segui il processo di assemblaggio dei peptidi tramite spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier (FTIR) ogni pochi giorni. Un ampio picco centrato intorno a 1670 ^cm-1 è la firma IR derivante da peptidi non assemblati nel campione. I campioni di assemblaggio dei peptidi di solito impiegano da una a due settimane prima che l'ampio picco non assemblato scompaia e raggiunga la maturazione.
      1. Essiccare un'aliquota di 8-10 μl della soluzione di assemblaggio sotto forma di film sottile sul cristallo di diamante ATR. Monitorare la scomparsa di un picco d'acqua grande e largo da 1640 a 1630 ^cm-1 mentre si forma il film secco.
      2. Acquisisci spettri IR da 1500-1800 ^cm-1 con una media di 50 scansioni con una risoluzione di 2 ^cm-1. Acquisisci e sottrai le scansioni in background prima di ogni scansione di esempio. La firma IR per l'assemblaggio di fogli β è un picco acuto compreso tra 1625 e 1635 ^cm-1 (Figura 1A).

Risultati

Figura 1. Caratterizzazione supramolecolare del peptide modificato con 1,2-ditiolano. (A) FT-IR di 1 mg/mL di fibre 1,2-ditiolano-KLVFFAQ-NH₂ assemblate in 10mM HEPES, pH 7,5 in 20% CH₃CN. Il picco a 1627 ^cm-1 è coerente con i peptid...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4	Infiammabile; irritante per gli occhi; Utilizzare dispositivi di protezione individuale; Utilizzare solo sotto una cappa aspirante; tenere lontano da fiamme libere o superfici calde; in caso di contatto sciacquare con acqua per almeno 15 minuti e consultare un medico
4-(2-idrossietil)piperazina-1-etansolfonico	Acros Organics	AC172571000	Non inalare; utilizzare all'aperto o in un'area ben ventilata
Spettrometro a infrarossi a trasformata di Fourier	Alpha Tensor, Bruker