Modulazione dell'eccitabilità corticale in un ratto mediante stimolazione magnetica transcranica ripetitiva

Abstract

Fonte: Beom, J., et al. Stimolazione magnetica transcranica ripetitiva all'emisfero unilaterale del cervello di ratto. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra l'applicazione della stimolazione magnetica transcranica ripetitiva (rTMS) nei ratti anestetizzati per modulare l'eccitabilità corticale. La procedura prevede la determinazione della soglia motoria (MT) per stabilire la stimolazione basale, seguita dall'applicazione di rTMS a un'intensità superiore alla MT per indurre la depolarizzazione neuronale. Questa stimolazione innesca l'afflusso di calcio, promuove la produzione di fattori neurotrofici e migliora la plasticità sinaptica, influenzando in ultima analisi l'eccitabilità corticale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Configurazione sperimentale

1. Preparazione animale
   1. Consenti ai ratti maschi di Sprague-Dawley 1 settimana di adattarsi al loro nuovo ambiente prima di iniziare l'esperimento.
      NOTA: Sebbene nel presente studio siano stati utilizzati ratti di 8 settimane, un cervello in via di sviluppo o adulto può essere scelto in base alle ipotesi di ricerca.
2. Anestesia per inalazione per induzione
   1. Induci e mantieni l'anestesia con il 5% e il 2% di isoflurano disciolti rispettivamente nel 40%/60% e nel 25%/75% di ossigeno/azoto attraverso una camera e un cono nasale. Regolare la profondità dell'anestesia al livello di abolizione del riflesso di ritiro del pedale al pizzicamento delle dita dei piedi per confermare una corretta anestesia.
      NOTA: L'uso di animali svegli può essere una scelta migliore in termini traslazionali, ma ci sono difficoltà nel trattenerlo durante la rTMS e sono inclini a uno stress eccessivo.
   2. Monitorare la temperatura corporea con una sonda rettale e mantenerla a 37 °C utilizzando una coperta omeotermica. Monitorare la profondità dell'anestetico utilizzando il riflesso di ritiro del pedale, la temperatura, la frequenza respiratoria e la frequenza cardiaca.
3. Passa all'anestesia endovenosa per il mantenimento
   1. Prepara la coda con un tampone imbevuto di alcol. Cateterizzare una vena caudale laterale con un catetere venoso calibro 24 per il passaggio all'anestesia endovenosa (IV) (Figura 1A). Caricare il propofol per via endovenosa (1 mg/[kg·min] in 10 minuti, utilizzando un'emulsione da 10 mg/ml) agli animali. Interrompere l'isoflurano 5 minuti dopo aver iniziato il caricamento del propofol.
   2. Mantenere la sedazione con propofol a una velocità di infusione di 500 - 700 μg/(kg·min) durante l'esperimento, come in uno studio precedente. Integrare l'ossigeno a 0,8 L/min tramite un cono nasale.
      NOTA: L'anestesia con propofol serve a ridurre la potenziale soppressione dell'eccitabilità corticale da parte dell'agente inalatorio. Tuttavia, l'anestesia non è obbligatoria negli esperimenti rTMS e possono essere utilizzati anche animali risvegliati. I metodi di anestesia devono essere decisi in considerazione delle ipotesi di ricerca.
   3. Utilizzare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
   4. Applicare la stimolazione magnetica (vedere Sezione 2) 10 minuti dopo il passaggio completo all'anestesia endovenosa .
4. Condizioni di recupero
   1. Monitora i segni vitali durante la fase di recupero. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Se un animale è stato sottoposto a un intervento chirurgico, non restituirlo alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
      NOTA: Se viene eseguito un intervento chirurgico per un modello di malattia, è necessaria la gestione del dolore post-operatorio. Tuttavia, la gestione del dolore non è necessaria per questo esperimento rTMS.

2. Stimolatore di

stimolazione magnetica transcranica ripetitiva

1. e bobina
   1. Applica la stimolazione utilizzando uno stimolatore ripetitivo che eroga stimoli bifasici tramite una bobina a forma di 8 da 25 mm. Individuare il centro della bobina a 0,5 cm lateralmente al vertice sulla linea biauricolare e inclinare la bobina di 45° rispetto al suolo.
      NOTA: L'intensità massima del campo magnetico della bobina è di 4,0 T. La bobina magnetica è montata saldamente su un supporto incorporato.
2. Soglia del motore
   1. Determina la soglia del motore (MT) nel punto caldo, con il centro della bobina posizionato a 0,5 cm lateralmente al vertice sulla linea biauricolare e con la superficie piatta sulla calvaria. Questa è la stessa metodologia utilizzata in uno studio precedente.
      NOTA: Definisci la MT come l'intensità minima dello stimolo che evoca 5 o più contrazioni palpabili sulla zampa anteriore controlaterale da 10 stimoli consecutivi. Verificare se la stimolazione sta causando principalmente la contrazione muscolare controlaterale per garantire una stimolazione unilaterale.
3. Applicazione di rTMS
   1. Applicare rTMS 10 minuti dopo la stabilizzazione dell'anestesia profonda. Posizionare il centro della bobina nel sito rTMS target, selezionato dalle cortecce cerebrali in base alle domande della ricerca. Quindi, inclinare la bobina per garantire il contatto diretto tra il centro della bobina e la superficie del cranio nel punto di stimolazione.
      NOTA: Ad esempio, angolare la bobina di 45° rispetto al suolo per ridurre al minimo un potenziale effetto diretto della rTMS sulla corteccia controlaterale (Figura 1B e 1C).
   2. Sottoporre gli animali a una sessione di 20 minuti di rTMS dell'emisfero unilaterale. Utilizzando la console del software, è possibile erogare rTMS con un protocollo di stimolazione a bassa frequenza (1 Hz), ad alta frequenza (20 Hz) o fittizio e impostare l'intensità della stimolazione al 100 - 110% della MT.
   3. Eseguire la stimolazione a 1 Hz senza riposo. Utilizzando la console software, inserire "1.200" colpi per "20" min. Per la stimolazione a 20 Hz, condurre 2 secondi di stimolazione seguiti da 28 secondi di riposo. Utilizzando la console software, inserire "1.600" scatti per "20" min.
   4. Per una stimolazione fittizia, inclinare la bobina perpendicolarmente (rotazione di 90°) alla calvaria e posizionare il bordo della bobina a 2 cm di distanza dalla superficie della testa (Figura 1D). Fissare saldamente il portabobina all'apparecchio principale; non è necessario tenere la bobina con la mano durante l'esperimento.
      NOTA: Per compensare gli effetti acustici e altri effetti non specifici, è necessario utilizzare protocolli fittizi distinti per protocolli di stimolazione distinti. Ad esempio, la stimolazione fittizia a 1 Hz può essere utilizzata per esperimenti rTMS a 1 Hz.
4. Raffreddamento della bobina
   1. Utilizzare un sistema di raffreddamento ad acqua per consentire la stimolazione magnetica ripetitiva per più di 20 minuti a frequenze di stimolazione di 1 e 20 Hz (Figura 2). Far circolare l'acqua ghiacciata che circonda l'intera lunghezza della bobina durante l'esperimento per evitare il surriscaldamento, anche se la temperatura della bobina o dello stimolatore non è monitorata.
      NOTA: È possibile utilizzare anche bobine di ratto raffreddate disponibili in commercio.
   2. Se possibile, monitorare la temperatura della bobina visualizzando l'indicatore di riscaldamento della macchina rTMS.
      NOTA: Non ci sono state conseguenze negative legate alla stimolazione rTMS. Esiste, tuttavia, un potenziale rischio di ustioni se le etichette metalliche di identificazione dell'orecchio vengono utilizzate vicino alla bobina stimolante.

Risultati

Figura 1. Impostazioni sperimentali. (A) Un catetere endovenoso viene inserito in una vena caudale laterale (freccia) e un cono nasale viene utilizzato per l'anestesia con isoflurano e per l'integrazione d...

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