Microiniezione di cervello di roditore con un microago di quarzo

Abstract

Fonte: Paolone, G., et al. Aghi personalizzati per microiniezioni nel cervello dei roditori. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra un'iniezione di microaghi per cervello di roditore utilizzando un microago di quarzo con fori. Il microago è collegato a una siringa e a una micropompa per controllare la velocità di erogazione. L'ago con la soluzione iniettabile viene inserito nel cervello con la velocità di erogazione impostata su bassa. Una volta posizionato, la velocità di erogazione viene aumentata. L'ago viene estratto dopo una breve pausa.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione degli aghi di quarzo Pulire

1. e sterilizzare i capillari di quarzo (vedi Tabella dei materiali) mettendoli per 5 minuti in acqua distillata, 5 minuti in etanolo al 99% e 5 minuti in etere etilico.
2. Lasciare i capillari sotto la cappa per almeno 1 h per farli asciugare completamente.
3. Preparare gli aghi utilizzando un estrattore laser secondo parametri che consentano la produzione di un ago sufficientemente lungo e sufficientemente sottile, a seconda delle esigenze individuali.
   NOTA: Utilizziamo un estrattore laser (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare un programma a due linee per tirare. La prima linea utilizza un'elevata potenza, la massima lunghezza di scansione (corrispondente al VALORE DEL FILAMENTO) e nessuna forza di trazione. Questa combinazione di parametri porta alla fusione della porzione più grande del capillare con la più bassa velocità di estensione, consentendo la sagomatura di un ago lungo con una grande dimensione interna/esterna e un gambo ridotto. In questo modo, l'ago conserva un'elevata resistenza meccanica e un ampio diametro interno che permette il passaggio di cellule staminali o particelle virali senza intasamento. La velocità e il ritardo di questa linea di programma dovrebbero arrestare l'estensione capillare prima che la punta diventi troppo piccola e lunga, mancando le caratteristiche meccaniche e di forma richieste. La seconda riga del programma di trazione viene eseguita automaticamente una volta che il quarzo si è raffreddato (5 s). I parametri di potenza, filamento e forza di trazione sono funzionali per tagliare una punta con la lunghezza della punta più corta possibile e il gambo ripido, evitando la separazione dei due aghi con una rottura della punta. Abitualmente, con le nostre apparecchiature, utilizziamo quanto segue: (a) Linea 1 = potenza 990, filamento 5, velocità 130, ritardo 110, tiro 0; (b) Linea 2 = potenza 970, filamento 3, velocità 0, ritardo 70, tiro 0.
4. Mettere gli aghi in una capsula di Petri precedentemente pulita con etanolo al 70%.
   1. Copri il piatto con una pellicola di plastica di paraffina.
5. Tagliare i capillari con il micro-dissettore.
   1. All'avvio, lascia che il laser esegua un processo di autocalibrazione per verificare la potenza e l'energia erogate. Quindi, impostare i parametri di taglio.
      NOTA: Utilizziamo un micro-dissettore (vedi Tabella dei materiali) e i seguenti parametri: energia dell'impulso di potenza laser (63 μJ), diametro del raggio laser del 20% dell'apertura massima (apertura massima: 1,0 μm) e velocità di taglio del 10% della velocità massima (velocità massima: 30 μm/s).
   2. Fissare saldamente l'ago sul tavolo del microscopio e posizionarne la punta al centro dello schermo del computer.
   3. Sulla barra dei menu, fai clic sull'icona della matita e usala per disegnare un segno per il taglio laser dell'ago.
      NOTA: Il taglio deve essere ad un angolo di circa 45° rispetto alla superficie dell'ago.
   4. Nella funzione della barra laterale, selezionare la bandierina contenente il pulsante "INIZIA TAGLIO" per consentire al laser di tagliare il punto precedentemente segnato.
   5. Se necessario, praticare i fori laterali ripetendo le procedure descritte al punto 1.5.2-3; non è necessario riposizionare l'ago (Figura 1).
6. Pulizia post-taglio.
   1. Collega l'ago a una pompa del vuoto attraverso un tubo di plastica.
   2. Accendere la pompa e impostare manualmente la portata di andata a una velocità moderata (3 μl/min).
   3. Aspirare prima l'etanolo al 99% e poi l'acqua distillata per rimuovere le impurità dovute al taglio.
   4. Aspirare nuovamente l'etanolo al 99% per facilitare l'asciugatura.
      NOTA: Ogni passaggio dovrebbe durare almeno 3 minuti.
7. Conservare gli aghi in una capsula di Petri adeguatamente coperta fino al giorno dell'intervento.
8. Gli aghi possono essere riutilizzati; alla fine dell'esperimento, pulire con candeggina ed etanolo per rimuovere la soluzione e gli eventuali residui di tessuto. Per una pulizia più completa, mettere gli aghi in un barattolo per micropipette con la punta rivolta verso il basso, riempire il barattolo con acqua distillata fino a coprire le punte, far bollire per 1,5 minuti per rimuovere eventuali residui di tessuto, quindi lavare con etanolo.

2. Procedura

1. Seguendo le istruzioni fornite dal manuale d'uso della pompa, selezionare il menu delle impostazioni per calibrare la pompa in base al diametro/volume della siringa per microiniezione e impostare la portata a 0,3 μL/min.
2. Riempire una siringa da 10 ml dotata di un ago smussato (ad es. ago Hamilton, 30 G) e un tubo corto di politetrafluoroetilene con acqua sterile e utilizzarlo per riempire la siringa per microiniezione (dopo aver rimosso con molta cautela il pistone) e il kit di parti di montaggio per iniezione per la pompa di microiniezione manuale (MMP).
   NOTA: Il kit MMP viene utilizzato per montare saldamente l'ago nel telaio stereotassico (Figura 2). Il kit comprende un tubo in politetrafluoroetilene, un accoppiatore luer-to-tube, un portapipette e guarnizioni per pipette con diametri esterni diversi.
3. Collegare l'ago al kit MMP.
   1. Risciacqua più acqua attraverso il sistema attraverso la siringa da 10 ml e controlla se l'acqua esce dall'ago.
      NOTA: Assicurati di rimuovere eventuali bolle d'aria all'interno del sistema ripetendo i passaggi di riempimento.
4. Scollegare la siringa da 10 ml dalla siringa per microiniezione spingendo lentamente il pistone in modo da lasciare una goccia d'acqua nella parte superiore della siringa per microiniezione. Inserire il pistone nella siringa per microiniezione.
5. Collegare la siringa per microiniezione alla pompa e impostare la portata a 0,3 μL/min.
   NOTA: Attendere che ci sia una goccia che fuoriesce dalla punta dell'ago, quindi lasciarla andare per altri 3 minuti.
6. Impostare il flusso a 0,1 μL/min e avviare la procedura chirurgica. La pompa deve essere in funzione durante l'esecuzione dell'intervento chirurgico.
   NOTA: Per gli esperimenti riportati in questo articolo, utilizziamo ratti Sprague Dawley maschi di 300 g (3 mesi di età). Tuttavia, la procedura è applicabile ad altre specie, in particolare ai topi.
7. Indurre l'anestesia generale utilizzando un metodo approvato dalle normative locali.
   NOTA: Utilizziamo una miscela di iniezione intraperitoneale (i.p.) di 85 mg/kg di ketamina e 8 mg/kg di xilazina per 20-50 minuti di anestesia. È importante che vengano utilizzati pizzichi per la coda e/o le dita dei piedi per garantire che l'animale sia completamente sedato. Il livello di anestesia e i parametri vitali di base vengono valutati prima dell'inizio dell'intervento e monitorati ogni 10 minuti durante l'esecuzione dell'intervento. La temperatura corporea dell'animale viene mantenuta costante prima, durante e dopo le procedure chirurgiche utilizzando un termoforo a ricircolo d'acqua. Gli animali vengono monitorati fino al completo recupero (ad esempio, sono in posizione eretta e deambulanti). Inoltre, gli animali ricevono analgesici (tramadolo, 5-7 mg/kg i.p.) dopo l'intervento ogni 24 ore per tre giorni.
   1. Radi la testa dell'animale e prepara adeguatamente il sito chirurgico per la chirurgia asettica. Eseguire uno scrub in due fasi con una soluzione a base di iodio (Betadine) seguita da etanolo al 70%. Inoltre, per mantenere l'asepsi, avvolgere il sito chirurgico con un telo chirurgico (nel video è stato omesso a scopo dimostrativo).
8. Posizionare il ratto nel telaio stereotassico sopra una coperta riscaldante a ricircolo d'acqua. Per fornire ulteriore sollievo dal dolore, nel sito dell'intervento chirurgico, applicare una soluzione di lidocaina allo 0,5% (non superare i 7 mg/kg). Pre-sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici utilizzando uno sterilizzatore a microsfere o una disinfezione a freddo liquida immergendo l'apparecchiatura in glutaraldeide al 2% e fenolo al 7,05% (sporodicina o cidex), seguito da un risciacquo con acqua sterile o soluzione fisiologica. La disinfezione deve essere eseguita anche tra una procedura e l'altra. Fai un taglio longitudinale sul cranio usando un bisturi sterilizzato. Sii delicato per evitare sanguinamenti eccessivi. Aprire il cuoio capelluto utilizzando una spatola piatta e applicare clip chirurgiche sui lembi di pelle per mantenerlo aperto. Molto delicatamente, staccare il periostio per esporre il bregma e l'area del cranio attraverso la quale verrà inserito l'ago.
9. Montare il braccio sul telaio stereotassico (mentre il flusso è in corso) e muovere la punta dell'ago esattamente sopra il bregma, facendo attenzione a non romperne la punta. Annotare le coordinate antero-posteriore e medio-laterale della bregma e tradurle nelle coordinate desiderate. Guidati da uno stereomicroscopio, abbassare l'ago fino a toccare quasi il cranio, segnare il punto di perforazione dopo aver sollevato un po' il braccio stereotassico.
10. Forare (punta Ø: 0,8 mm; velocità di foratura: 1.000 giri/min) il cranio nel punto contrassegnato. Prestare attenzione a non penetrare nella dura madre durante le procedure di perforazione. Durante la perforazione, gocciolare soluzione fisiologica sterile per evitare danni alle ossa e necrosi.
11. Taglia un pezzetto di pellicola di paraffina di plastica e posizionalo sul cranio. Utilizzando la pipetta da 10 μL, fare una goccia della soluzione da iniettare sul film di paraffina di plastica. Arrestare la pompa, recuperare leggermente lo spintore della pompa e creare una piccola bolla d'aria nel capillare tirando delicatamente il pistone della siringa per microiniezione.
12. Abbassare il braccio stereotassico fino a quando la punta dell'ago raggiunge la goccia. Prelevare il campione tirando (molto lentamente) il pistone della siringa per microiniezione, evitando la formazione di bolle. Sostituire lo spingipompa a contatto con il pistone e accendere la pompa ad una portata di 0,3 μL/min. Attendere la formazione di una goccia (alcuni minuti) prima di procedere al passaggio successivo.
    NOTA: Nel presente esperimento di esempio, il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) è stato infuso nello striato [AP (anteroposteriore): +1,5, ML (mediolaterale): ±2,7; DV (Dorso-Ventrale): -5.0] e nell'ippocampo dorsale (AP: -3.5, ML: ±2.1; DV: -3,5; in mm da dura), 2 μL/sito. Per facilitare il confronto tra i due metodi di iniezione, ogni area del cervello è stata infusa utilizzando un ago di quarzo in un emisfero e un ago smussato da 26 G o un ago in acciaio inossidabile da 30 G nell'altro.
13. Abbassare il flusso a 0,1 μL/min, intaccare la dura madre con un ago a punta conica in acciaio inossidabile e abbassare lentamente il braccio stereotassico sull'asse dorso-ventrale, entrando nel tessuto cerebrale. Quando viene raggiunta la posizione desiderata, scendere di altri 0,1 mm, arrestare la pompa, sollevare il braccio stereotassico di 0,1 mm e riavviare la pompa al flusso a 0,3 μL/min.
    NOTA: Il motivo per mantenere un flusso lento durante l'abbassamento dell'ago è garantire una pressione positiva che eviti la penetrazione di piccoli frammenti di tessuto nell'ago stesso. Un tale evento ostruirebbe la punta, compromettendo l'erogazione della soluzione. Poiché la velocità di flusso è molto lenta durante l'abbassamento dell'ago e la velocità di abbassamento è di circa 10 s/mm, ciò implica che le quantità di soluzione che rimangono lungo la traccia dell'ago sono trascurabili rispetto a quelle iniettate nel sito target. Questa precauzione può essere evitata quando si utilizzano aghi con fori laterali.
14. Avviare il timer e attendere il tempo necessario a seconda del volume desiderato da iniettare (ad esempio, 6 minuti e 40 s se si iniettano 2 μL). Monitorare il movimento della bolla durante l'iniezione. Al termine, arrestare la pompa e attendere 5 minuti prima di recuperare lentamente l'ago. Quando l'ago di quarzo è completamente estratto, riavviare la pompa e verificare la formazione di una goccia sulla punta dell'ago.
15. Sigillare l'apertura nella superficie del cranio con cera ossea, rimuovere le clip emostatiche e suturare il cuoio capelluto, rivestire l'area intorno alla ferita con una crema antibiotica (ad es. neosporina) e riportare l'animale nella gabbia di casa.

Results

Figura 1: Immagine microscopica della punta di un ago di quarzo, che mostra diversi diametri della punta e dei fori utilizzati per l'iniezione di fluidi. Immagine a basso ingrandimento in (A) e ingrandimento maggiore in (B) e (C). L'ago può es...

Materials