Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Iniezioni intramuscolari alle placche terminali del motore
- Tirare le micropipette di vetro con un estrattore per micropipette (si consiglia l'uso di micropipette graduate con stantuffi). Con l'aiuto di un microscopio da dissezione, rompere le punte delle micropipette con un paio di pinze in modo che il diametro interno del lume della micropipetta sia di circa 0,5 mm.
- Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici utilizzati siano appena sterilizzati in autoclave e che l'area chirurgica sia sterile.
- Riempire le micropipette con Fluoro-Gold (5% in acqua distillata).
- Indurre l'anestesia nell'animale utilizzando isoflurano (4% in O2) in una camera di induzione. Verificare la presenza del riflesso raddrizzante e verificarne l'assenza prima di rimuoverlo dalla camera di induzione. Fissare un cono nasale sul muso del ratto e somministrare isoflurano (2% in O2) per il mantenimento dell'anestesia. Pizzicare le dita dei piedi dell'animale e toccare delicatamente l'occhio dell'animale per assicurarsi che sia il ritiro del pedale che i riflessi corneali siano assenti.
NOTA: Può essere utilizzata anche una miscela di ketamina e xilazina (80 e 10 mg/kg, rispettivamente, somministrati per via intraperitoneale). La ketamina è una droga della Tabella 8 ("Controllata") e dovranno essere rispettati i protocolli necessari associati all'acquisto, all'uso, alla conservazione e allo smaltimento della droga. - Applicare un lubrificante per gli occhi per prevenire la secchezza degli occhi durante il corso della procedura.
- Radere l'arto interessato e utilizzare una garza per pulire l'area rasata con tre scrub alternati di clorexidina e alcol al 70%. Trasferire l'animale nell'area chirurgica.
- Posiziona l'animale su un sottopiede pulito e posizionalo in modo appropriato per garantire un buon accesso ai muscoli mirati.
- Usa un paio di pinze con impugnature per denti per sollevare la pelle sopra il muscolo mirato lontano dalla muscolatura sottostante e praticare un'incisione nella pelle con le forbici chirurgiche. Assicurarsi che l'incisione sia abbastanza grande da esporre completamente il muscolo o i muscoli di interesse. Assicurarsi che la fascia sia disturbata al minimo.
- Utilizzare le fotografie della piastra terminale del motore (MEP) per trasporre mentalmente la posizione e la forma della regione MEP sui muscoli.
NOTA: Un pennarello fine potrebbe aiutare a riprodurre la regione MEP dalla fotografia sui muscoli di interesse. - Eseguire iniezioni multiple lungo l'intera lunghezza della regione MEP (per il Fluoro-Gold, dovrebbero essere sufficienti da 3 a 4 iniezioni di 1-2 μl ciascuna). Strofinare delicatamente i muscoli per rimuovere eventuali infiltrazioni.
- Avvicinare le due estremità della pelle incisa con una pinza smussata e chiudere la ferita con clip chirurgiche. Infiltrare 0,1 ml di Bupivacaina (0,5% in acqua) (o altri anestetici locali) lungo l'intero arco della ferita.
- Spegnere la macchina per l'anestesia e monitorare l'animale fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia.
- Attendere 14 giorni tra la somministrazione di iniezioni intramuscolari e la perfusione degli animali.
