Consegna mirata di siRNA ai neuroni per il silenziamento della proteina prionica utilizzando complessi liposomiali

Abstract

Fonte: Bender, H. R., et.al. Somministrazione di siRNA terapeutico al SNC utilizzando liposomi cationici e anionici. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra la somministrazione mirata di siRNA della proteina prionica (PrP) ai neuroni utilizzando complessi liposomiali siRNA-peptidi (LSPC). I liposomi cationici legano elettrostaticamente il siRNA bersaglio di PrP, che è ulteriormente stabilizzato dal peptide RVG-9r per il trasporto mediato dal recettore attraverso la barriera emato-encefalica. Una volta all'interno del cervello, le LSPC subiscono endocitosi nei neuroni, rilasciando siRNA per avviare l'interferenza dell'RNA, riducendo l'espressione della PrP e interrompendo la progressione della malattia da prioni.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione degli LSPC

1. Utilizzare un rapporto DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilammonio-propano): 1:1 per gli LSPC. Per una preparazione di liposomi a 4 nmole, mescolare 2 nmoles di DOTAP e 2 nmoles di colesterolo in 10 ml di una soluzione di cloroformio:metanolo 1:1 in un pallone.
2. Evaporare 9 ml della soluzione di cloroformio:metanolo utilizzando il gas N₂ in una cappa aspirante. Far evaporare l'ultimo 1 ml di solvente in una cappa aspirante per una notte senza gas. Osservare un sottile film lipidico sul fondo del pallone.
3. Scaldare 10 ml di una soluzione di saccarosio al 10% a 55 °C.
4. Versare lentamente la soluzione riscaldata di saccarosio al 10% sul film lipidico sottile, cioè 1 ml/min, agitando delicatamente il pallone. Mantenere il 10% di saccarosio e insaponare con i lipidi a 55 °C in modo che le molecole lipidiche rimangano nella fase gel-liquido. La reidratazione provoca la formazione di vescicole multilamellari (MLV).
5. Lasciare reidratare i lipidi a 55 °C per almeno un'ora prima di dimensionare i liposomi.
6. Assemblare un estrusore secondo le istruzioni del produttore con filtri da 1,0 μm o utilizzare filtri per siringa da 1,0 μm per il dimensionamento.
7. Aggiungere 1 ml di sospensione liposomica riscaldata a una delle siringhe dell'estrusore e passare la sospensione tra le due siringhe 11 volte. Assicurarsi che la sospensione si trovi nella siringa opposta a quella iniziale dopo i passaggi 11.
8. Dimensionare nuovamente i liposomi attraverso filtri da 0,45 μm e 0,2 μm per generare grandi vescicole unilamellari (LUV). Mantenere la sospensione liposomica riscaldata per facilitare il dimensionamento.
9. Incubare 20 μl della sospensione liposomica da 4 nmoli (200 μM) con 200 μl di una soluzione madre di siRNA da 20 μM (4 nmole totali) per 10 minuti a temperatura ambiente.
10. Incubare 80 μl di una soluzione madre di RVG-9r da 500 μM (40 nmole totali) con la soluzione siRNA/liposoma per 10 minuti a RT. Gli LSPC devono essere utilizzati il prima possibile, ma possono essere utilizzati fino a diverse ore dopo la preparazione. Conservare gli LSPC a 4 °C per diverse ore dopo la preparazione.

2. Iniezione di topi con LSPC

1. Esporre i topi per 5-10 minuti a una lampada termica per dilatare la vascolarizzazione.
2. Anestetizzare il topo con un flusso di isofluorano/ossigeno al 2-3% 5-10 minuti prima dell'iniezione e durante l'iniezione. Confermare l'anestesia quando l'animale non è più deambulante e la respirazione è rallentata, facendo un pizzicotto con le dita dei piedi. Posiziona il mouse sul retro o sul lato per accedere alla vena della coda. Usa un unguento veterinario sugli occhi del topo per evitare che si secchi durante l'anestesia.
3. Pulire/spruzzare la coda con il 70% di EtOH e iniettare 300 μl di LSPC sulla vena caudale del topo utilizzando una siringa da insulina da 26 G. Inizia a iniettare distalmente nella vena caudale e muoviti prossimalmente se la vena collassa o si rompe.
4. Metti il topo in una gabbia pulita fino a quando non mantiene la decubito sternale. Non posizionare il mouse con altri compagni di gabbia fino a quando non si è completamente ripreso. I topi dovrebbero riprendersi in 5-15 minuti. Possono essere posizionati su un termoforo o sotto una lampada termica per mantenere la temperatura corporea se il recupero richiede più tempo. I topi devono essere monitorati attentamente per evitare il surriscaldamento.
5. Monitorare l'animale diverse ore dopo l'iniezione per assicurarsi che l'anestesia svanisca e che non vi siano effetti negativi del trattamento. Lasciare che gli LSPC circolino per almeno 24 ore.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DOTAP lipidi	Avanti Lipids	890890
Colesterolo	Avanti Lipids	700000
Cloroformio	Fisher Scientific	AC268320010
Metanolo	EMD Millipore	113351
Gas N₂	AirGas
Saccarosio	Fisher Scientific	S5-500
Estrusore	Avanti Lipids	610023
filtri da 1,0, 0,4 e 0,2 μm	Avanti Lipids	610010, 610007, 610006