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Caratterizzazione di cellule staminali mesenchimali geneticamente modificate per applicazioni neuroterapeutiche

August 7th, 2025

In This Article

Abstract

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Fonte: Sharma, A. D., et.al. Caratterizzazione ad alto rendimento di cellule staminali adulte ingegnerizzate per la somministrazione di fattori terapeutici per strategie neuroprotettive. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video mostra il processo di caratterizzazione delle cellule staminali mesenchimali transgeniche ingegnerizzate per esprimere fattori neurotrofici terapeutici. Delinea le fasi coinvolte nella fissazione, permeabilizzazione e colorazione delle cellule con anticorpi primari e secondari mirati a un marcatore di proliferazione cellulare, seguiti dall'analisi utilizzando un sistema di screening ad alto contenuto per catturare i segnali fluorescenti nei nuclei. L'aumento dell'espressione del marcatore di proliferazione conferma l'idoneità delle cellule transgeniche per applicazioni neuroterapeutiche.

Protocol

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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Saggio di proliferazione cellulare Ki67

  1. Saggio di proliferazione cellulare Ki67 (immunocitochimica)
    1. Risciacquare le colture cellulari con tampone 0,1 M fosfato (PO4) per un minuto due volte. Fissare la coltura con paraformaldeide (PFA) al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il PFA e sciacquare i pozzetti con PBS per sette minuti tre volte.
    2. Dopo il risciacquo finale, aggiungere 100 μl di soluzione bloccante (soluzione salina tampone fos....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Piastre a 96 pozzettiGreiner Bio One655090Piastre a 96 pozzetti selezionate per l'uso in ImageXpress
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)A9647
Anticorpo anti-Ki67 di coniglioAbcam ( Cambridge, MA)Ab16667Diluizione 1:200
DAPIInvitrogen (Carlsbad, CA)D3571
Donkey anti-Rabbit Cy3Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)711-165-152Diluizione 1:500
MSC di topo di topi adulti C57BL/6Tulane Cent per terapia genica (New Orleans, LA) Isolato dal midollo osseo
MSC geneticamente modificate (GFP, BDNF, GDNFQuestecellule sono state ottenute dal nostro studio precedente: Ye et. al. (in preparazione)
Siero d'asino normale (NDS)Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)017-000-121
Paraformaldeide (PFA)Fisher Scientific (Hampton, NH)O40424% PFA in tampone PO4 0,1M
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)P4417
Triton X-100Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)X100
ImageXpress MicroMolecular devices (Sunnyvale, CA)ImageXpress microSistema di screening ad alto contenuto
MetaXpress 4.0Molecular devices (Sunnyvale, CA)MetaXpress 4.0Software di acquisizione e analisi delle immagini
KH₂PO₄Fisher Scientific (Hampton, NH)P285Per tampone PO₄
K₂HPO₄Fisher Scientific (Hampton, NH)P288Per tampone PO₄

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Mesenchymal Stem CellsNeurotrophic FactorsCell Proliferation AssayHigh Content ScreeningImmunofluorescence StainingKi 67 MarkerGFP ExpressionParaformaldehyde FixationSecondary AntibodiesDNA Binding Dye

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