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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Saggio di proliferazione cellulare Ki67
- Saggio di proliferazione cellulare Ki67 (immunocitochimica)
- Risciacquare le colture cellulari con tampone 0,1 M fosfato (PO4) per un minuto due volte. Fissare la coltura con paraformaldeide (PFA) al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il PFA e sciacquare i pozzetti con PBS per sette minuti tre volte.
- Dopo il risciacquo finale, aggiungere 100 μl di soluzione bloccante (soluzione salina tampone fosfato, siero d'asina normale al 5%, siero di albumina bovina allo 0,4% e Triton X-100 allo 0,2%) in ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Preparare l'anticorpo primario, coniglio anti-Ki67, diluendo in soluzione bloccante a un rapporto di lavoro di 1:200.
- Rimuovere la soluzione bloccante e applicare 100 μl della soluzione di anticorpi primari su ciascun pozzetto. Coprire la piastra a 96 pozzetti e incubare i campioni a 4 °C per una notte.
- Il giorno seguente, rimuovere la soluzione di anticorpi e risciacquare con PBS per 7 minuti, 3 volte.
- Preparare l'anticorpo secondario, asino anti-coniglio Cy3 in soluzione bloccante ad un rapporto di lavoro di 1:500. Aggiungere la colorazione nucleare DAPI alla soluzione di anticorpi secondari a una diluizione di 1:100. Dopo la rimozione dell'ultimo risciacquo PBS, applicare 100 μl della soluzione di anticorpo secondario/DAPI su ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente al buio per 90 min.
- Rimuovere la soluzione secondaria di anticorpo/DAPI e sciacquare ogni pozzetto con PBS per 7 minuti, 3 volte. Coprire la piastra a 96 pozzetti e conservarla a 4 °C fino all'imaging.
2. Imaging automatizzato e analisi del punteggio a più lunghezze d'onda
- Caricare una piastra a 96 pozzetti (precedentemente elaborata per l'immunomarcatura Ki67) nel sistema HCS e lasciare che la piastra si equilibri per 20 minuti. Aprire il software di acquisizione e analisi delle immagini del sistema HCS.
- Scegliere le impostazioni di acquisizione per l'obiettivo 10X utilizzando il binning della fotocamera su 1 e un'impostazione di guadagno su 2. Trova il piano Z in cui risiedono le celle utilizzando la funzione Esposizione automatica e calcola l'offset per ogni lunghezza d'onda di interesse. Per questa analisi, acquisire immagini per DAPI (W1), Cy3 (W2). Scegliere il livello di intensità massimo al quale i pozzetti di controllo negativo non mostrano alcun segnale per l'acquisizione dell'immagine. Verificare che questa impostazione sia appropriata per i pozzetti positivi.
- Acquisisci piastra. Cattura le immagini e memorizzale nel database del software di acquisizione e analisi delle immagini.
- Una volta acquisite le immagini, aprire il software offline di acquisizione e analisi delle immagini e rivedere i dati delle lastre dalle immagini acquisite sopra.
- Selezionare l'analisi del punteggio a più lunghezze d'onda. Configurare le intensità minima e massima per ogni lunghezza d'onda.
NOTA: Il rilevamento DAPI dovrebbe contrassegnare la colorazione attorno a ciascun nucleo visibile. Cy3 dovrebbe rilevare le cellule positive con immunoreattività Ki67 (IR) e non dovrebbe rilevare IR sotto i controlli negativi. Per Cy3 Ki67 IR, la larghezza minima approssimativa era di 7 μm, la larghezza massima approssimativa era di 30 μm, l'intensità sopra lo sfondo locale era di 150 livelli di grigio e l'area minima colorata era di 50 μm2. - Esegui l'analisi per tutte le posizioni. Esporta i dati per visualizzarli in un foglio di calcolo.