$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Impianto iniziale del tumore intracranico
- Nella fase iniziale dello studio, iniettare intracranicamente ogni topo con 100.000 cellule (GL261 linea cellulare di glioma murino) sospese in 4 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS) a una profondità di 2,5 mm seguendo il rapporto precedentemente pubblicato.
- Quantificare il segnale tumorale in ciascun topo utilizzando il sistema di imaging in vivo 9 giorni dopo l'impianto del tumore.
NOTA: Se necessario, stratificare i topi in due gruppi in base al carico tumorale. Nel presente studio, i due gruppi erano: (1) topi con carico tumorale relativamente piccolo (segnale bioluminescente medio = 5,5e+006 ± 0,1e+006 fotoni/s, n = 10) e (2) topi con carico tumorale relativamente grande (segnale bioluminescente medio = 1,69e+007 ± 0,2e+007 fotoni/s, n = 10), (p < 0,05, test di Mann-Whitney). - Dividi ogni gruppo in due sottogruppi comparabili.
>NOTA: In questo studio, i due sottogruppi erano: topi non trattati (n = 5) e topi con tumori sottoposti a resezione chirurgica utilizzando il MIRS (n = 5), (p > 0,05, test di Mann-Whitney). - A partire dal giorno della resezione, monitorare la progressione del tumore utilizzando il sistema di imaging in vivo a una frequenza basata sul modello di crescita del tumore.
NOTA: Per la linea cellulare GL261, monitorare la progressione del tumore il giorno della resezione e poi ogni 3-6 giorni.
2. Resezione del tumore utilizzando MIRS
- Anestetizzare il topo utilizzando una miscela di gas isoflurano-O2 in una camera di induzione o iniezione intraperitoneale di soluzione di xilazina/ketamina.
- Se si utilizza l'anestetico gassoso, impostare la portata del gas su 1,0 ml/min e il vaporizzatore su 2,0% per l'induzione dell'anestesia, che in genere richiede 3-5 minuti nella camera (vedere la tabella dei materiali).
- Se si utilizza l'anestetico iniettabile, anestetizzare i topi iniettando 0,2 ml di soluzione anestetica (80-100 mg/kg di ketamina e 10-12,5 mg/kg di xilazina, vedere Tabella dei materiali) per via intraperitoneale.
- Valutare l'animale per un'adeguata sedazione pizzicando l'alluce. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per evitare la secchezza della cornea. Somministrare un analgesico (0,03-0,06 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea) prima della procedura.
- Posizionare il mouse sul telaio stereotassico (vedi Tabella dei materiali) una volta confermata la sedazione completa.
NOTA: Se si utilizza l'anestetico gassoso, posizionare il naso del topo in un cono nasale dove continuerà a ricevere la miscela di isoflurano-O2 durante la procedura (1,5%). - Rimuovere la graffetta precedente, quindi rimuovere i peli con una crema depilatoria o con la rasatura. Disinfettare la pelle con cicli alternati di scrub a base di clorexidina/betadina e alcool. Quindi, utilizzando un bisturi sterile, creare un'incisione longitudinale della linea mediana di 1 cm lungo la precedente cicatrice chirurgica.
- Fissare il manipolo MIRS al braccio stereotassico attraverso l'adattatore da tavolino/supporto del manipolo per una maggiore stabilità e precisione.
- Configurare la macchina MIRS (vedere Tabella dei materiali) utilizzando le seguenti impostazioni (Figura 1).
- Inserisci il cavo di alimentazione impostato sul pannello posteriore nella presa del cavo di alimentazione. Accendere o spegnere il sistema attivando o disattivando (1 = ON, 0 = OFF).
- Inserire un'estremità del tubo dell'azoto (fornito con la console) nel raccordo maschio sul pannello posteriore della console. Ruotare il dado di collegamento in senso orario per serrare il collegamento.
NOTA: L'estremità opposta del tubo deve essere collegata all'alimentazione dell'azoto. - Prima di collegare il tubo all'alimentazione dell'azoto, verificare che la pressione di alimentazione non superi i 100 psig, che è la pressione di alimentazione in ingresso consigliata per la console.
NOTA: La console genererà la propria aspirazione quando attivata dal pedale una volta che l'azoto è stato fornito alla console. - Fissare il coperchio della porta del vuoto e sigillarlo per evitare perdite nel sistema del vuoto. Eventuali perdite nel sistema di aspirazione influenzeranno le prestazioni della console MIRS.
- Se l'aspirazione è inferiore a 17 durante la configurazione o l'adescamento, verificare che la manopola di aspirazione sulla parte anteriore della console sia impostata al livello massimo (100), assicurarsi che non vi siano perdite nel sistema di aspirazione e verificare che la pressione di alimentazione dell'azoto in ingresso sia corretta.
- Per collegare il pedale alla consolle, inserire il connettore grigio del pedale nella sua presa grigia finché non scatta e si inserisce in posizione.
NOTA: Il connettore del pedale si collega alla consolle in un orientamento ed è codificato. - Per collegare il manipolo alla consolle, inserire il connettore blu del manipolo nella sua presa blu finché non scatta e si inserisce in posizione.
NOTA: Il connettore del manipolo si collega alla consolle in un orientamento ed è codificato. - Adescare ogni manipolo prima di utilizzare il sistema aspirando il fluido sterile da una piccola ciotola nell'apertura, attraverso il tubo e il manipolo, e quindi nel contenitore per garantire che l'interno del tubo e del manipolo sia lubrificato per ridurre le occlusioni tissutali.
- Prepararsi per l'aspirazione da sola o per l'aspirazione con taglio selezionando la modalità appropriata sul pannello frontale della console. Avviare utilizzando il pedale.
- Inserire la cannula MIRS da 23 G nel foro della fresa a una profondità di 2,5 mm.
- Avviare il processo di resezione premendo il pedale collegato alla cannula. Eseguire un ciclo completo (360°) o più di resezione utilizzando la manopola di controllo nel manipolo.
NOTA: Più cicli vengono eseguiti, maggiore è il volume di tessuto tumorale resecato. - Una volta completato il processo di resezione, estrarre la cannula MIRS da 23 G dal foro della fresa e utilizzare 5 ml di 1x PBS per lavare il tubo e rimuovere eventuali detriti residui.
- Rimuovere il mouse dal telaio stereotassico e chiudere la ferita con una cucitrice o materiale di sutura 4-0 (vedi Tabella dei materiali).
- Posizionare il mouse su un termoforo o sotto una luce riscaldante durante il recupero dall'anestesia prima di rimetterlo nella sua gabbia.
- Al termine dell'esperimento, spurgare la cannula mediante lavaggio. Alternare con terreni refrigerati e aria per "spingere" tutto il tessuto resecato nel contenitore di raccolta. Rimuovere il contenitore di raccolta dal sistema e chiudere con il tappo in dotazione.
- Dopo aver completato il passaggio 2.12, posizionare la punta distale della cannula al 3% H2O2 e applicare l'aspirazione a 24-25 in Hg per riempire la linea di aspirazione fino al contenitore di raccolta dell'aspirazione e lasciare riposare per 60-90 s. Sciacquare con terreno sterile che pulsa aria e terreno in modo intermittente.
- Monitorare i topi per eventuali segni neurologici (movimenti irregolari anormali o convulsioni) dopo la procedura.
