Effetto sinergico della somministrazione intracranica e intraperitoneale di farmaci analgesici sulla risposta al dolore termico in un ratto

Abstract

Fonte: Martinez, E., et al. Farmacoterapia intracranica e dosaggi del dolore nei roditori. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra la somministrazione intracranica di un farmaco analgesico in un ratto anestetizzato con una cannula guida pre-impiantata nella corteccia prefrontale. Un ulteriore farmaco analgesico viene co-somministrato per via intraperitoneale. Dopo il recupero, la risposta al dolore termico del ratto viene valutata utilizzando l'apparato di Hargreave, dove viene misurata la latenza di ritiro della zampa per valutare gli effetti analgesici dei farmaci somministrati.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Impianto di cannule stereotassiche

1. Utilizzare ratti maschi di Sprague-Dawley di 10-12 settimane.
2. Anestetizzare gli animali con l'1,5-2% di isoflurano. Una volta che l'animale diventa insensibile a un forte pizzicamento con una pinza affilata, eseguire l'intervento chirurgico. Assicurati di sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti, utilizzare guanti chirurgici sterili e aggiungere un unguento oftalmico agli occhi dell'animale per evitare danni.
3. Impiantare stereotassicamente cannule guida bilaterali calibro 26 nella corteccia prefrontale (PFC) con un angolo di 12,5 gradi con coordinate anteroposteriori (AP): +2,9 mm; mediolaterale (ML): +/- 1,6 mm; dorso-ventrale (DV): −2,1 mm. Per inserire le cannule, praticare dei fori nel cranio alle coordinate desiderate, con un diametro del foro in base alle dimensioni delle cannule utilizzate.
   NOTA: Qui, la PFC è stata studiata come potenziale bersaglio per gli impianti intracranici a causa del suo ruolo importante nell'elaborazione del dolore, che è stato dimostrato in una serie di studi precedenti. Per studiare la funzione di altre aree cerebrali specifiche, i ricercatori possono utilizzare diverse coordinate in base all'atlante cerebrale.
4. Lasciare che i ratti si riprendano dall'intervento chirurgico per almeno 1 settimana. Dopo l'intervento chirurgico, iniettare liquidi sottocutanei prima del recupero per aiutare a sostenere le esigenze metaboliche e applicare bupivacaina topica nell'incisione appena chiusa. Posiziona l'animale su un tappetino caldo fino al risveglio e monitora l'animale dopo l'operazione per 3 giorni per garantire una buona salute e un corretto recupero.
5. Una volta che gli animali si sono completamente ripresi dall'intervento chirurgico, iniziare le iniezioni (passaggio successivo).

2. Iniezioni intracraniche e intraperitoneali

1. Per le iniezioni intracraniche, utilizzare un tubo PE-50 collegato a un'estremità a siringhe Hamilton da 10 μL con una cannula per iniettore calibro 33 che si estende di 1,0 mm oltre le guide impiantate.
2. Iniettare 0,5 μL (o meno se lo si desidera) del farmaco in studio o della soluzione salina nella PFC di questi ratti. Poiché la PFC è una regione più grande nei ratti, questa quantità non si diffonderà ad altre regioni. Tuttavia, per le regioni cerebrali più piccole o per i topi, utilizzare un volume inferiore. La quantità iniettata dipenderà dalla regione del cervello e dalla specie animale.
   NOTA: Si prega di notare che la soluzione salina dovrebbe essere usata come controllo al posto del dimetilsolfossido (DMSO) perché il DMSO è neurotossico. Tuttavia, una quantità molto piccola di DMSO può essere sicura per l'infusione, poiché gli studi hanno dimostrato che meno del 50% di DMSO (cioè meno di un volume totale di 0,3 μL, come in questo caso) potrebbe non interferire con gli studi comportamentali.
3. Iniettare il volume bilateralmente per un periodo di 100 s e mantenere le cannule dell'iniettore in posizione per altri 60 s prima della rimozione per consentire una lenta diffusione di questa soluzione.
4. Per gli studi sugli effetti farmacologici sinergici, co-somministrare un altro farmaco attraverso metodi sistemici. In questo caso, iniettare il farmaco o il controllo desiderato per via intracranica e somministrare un farmaco aggiuntivo per via intraperitoneale subito dopo. Ad esempio, in questo studio, abbiamo studiato gli effetti analgesici sinergici della morfina e delle ampakine per testare un effetto additivo. Abbiamo infuso un'AMPAkine per via intracranica, in combinazione con la somministrazione intraperitoneale di 1 mg/kg di morfina (una dose sistemica sicura).
   NOTA: Si raccomanda di eseguire prima le iniezioni intracraniche, poiché sono più difficili da eseguire rispetto alle iniezioni intraperitoneali.

3. Saggi e valutazione dell'analgesia

1. Per studiare l'effetto delle iniezioni intracraniche sul comportamento del dolore acuto nei ratti, utilizzare il test plantare (test di Hargreaves) per calcolare la latenza di astinenza in risposta agli stimoli termici. L'apparato di Hargreaves focalizza un raggio infrarosso attraverso un piano di vetro sulla zampa del topo; Il topo è in piedi e si muove liberamente sopra il piano di vetro. Quando si esegue il test di Hargreaves, focalizzare il raggio infrarosso sotto l'area plantare della zampa del ratto.
   1. Inizia eseguendo i test di Hargreaves di base prima delle iniezioni per stabilire un valore di base per il confronto.
2. Non iniettare alcun farmaco di alcun tipo prima di aver stabilito un valore basale. Conduci cinque buone prove, a distanza di 5 minuti l'una dall'altra. Una buona prova è indicata da un ritiro chiaro, cioè quando il ratto piega il ginocchio e solleva il piede verso l'alto e nel corpo.
   NOTA: Assicurati che le prove siano a 5 minuti di distanza l'una dall'altra per prevenire la sensibilizzazione del ratto. L'apparato di Hargreaves registra automaticamente il tempo di prelievo, una volta che il raggio infrarosso viene interrotto. Di conseguenza, assicurati di scartare le prove di locomozione, spostamento del peso, ecc. Se si verifica una versione di prova scontata, attendere 5 minuti e ripetere la prova.
3. Calcola le soglie di prelievo facendo la media dei cinque studi.
4. Dopo aver ottenuto una media di base, iniziare l'esperimento per ottenere i tempi di sospensione dopo l'infusione dei farmaci. I test di Hargreaves possono essere eseguiti 20-30 minuti dopo le iniezioni intracraniche, anche se la tempistica precisa può dipendere dalla farmacocinetica degli agenti specifici. Questo per garantire che il ratto abbia assorbito il farmaco e ne stia sperimentando gli effetti. Condurre l'esperimento nello stesso modo del passaggio 3.1.
5. Calcola le soglie di prelievo come indicato nel passaggio 3.2.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cannula Sterotaxic	PlasticsOne	8I26GA8MMKIT
Siringa Digitale	Hamilton	8440
AMPAkine	Sigma Aldrich	C-271
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D4540
Hargreaves Apparecchio	Ugo Basile	37370
Maschio Sprague-Dawley ratti	Taconic Farms	NTac:SD
Guanti chirurgici sterili	Dynarex	6535