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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dell'animale per l'intervento
- chirurgico Eseguire le procedure chirurgiche in uno spazio pulito e dedicato. Autoclavare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici e sterilizzare con uno sterilizzatore a perle di vetro prima dell'intervento chirurgico.
NOTA: In questo protocollo, utilizzare topi FVB postnatali del giorno 10-12 (P10-12). Diverse età e ceppi di topi possono essere utilizzati per soddisfare le esigenze di un progetto specifico. I topi di età superiore a P40 possono essere difficili perché l'osso della bulla diventa più duro. - Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina cloridrato (100 mg/kg), xilazina cloridrato (10 mg/kg) e acepromazina (2 mg/kg). Iniziare la preparazione chirurgica solo dopo che l'animale non risponde più a stimoli dolorosi, come il pizzicamento delle dita dei piedi. Se necessario, somministrare una dose di richiamo (un quinto della dose originale) del cocktail anestetico per ripristinare il piano anestetico originale.
NOTA: Prestare attenzione in questo passaggio perché la maggior parte della mortalità osservata a questa età è causata da sovradosaggio di anestetico. - Copri gli occhi dell'animale con un unguento oftalmico protettivo per mantenere gli occhi umidi durante l'anestesia, sopprimendo il riflesso dell'ammiccamento dell'animale.
- Per prevenire l'ipotermia post-anestesia, posizionare il mouse con il collo esteso su un termoforo durante tutta la procedura fino a quando non è completamente sveglio.
- Radere la regione post-auricolare sinistra con un tagliacapelli e disinfettare con etanolo al 70% e iodio povidone prima della manipolazione chirurgica.
2. La procedura chirurgica e l'iniezione del vettore
- Utilizzare un approccio post-auricolare per esporre la bolla timpanica. Incidere il tessuto sottocutaneo con piccole forbici per esporre il muscolo post-auricolare. Dopo aver retratto il tessuto adiposo sul lato posteriore dell'incisione, separare i muscoli sui lati destro e sinistro perpendicolarmente all'incisione per esporre l'osso temporale. Assicurarsi che questa incisione sia sufficientemente lunga da funzionare comodamente con una visualizzazione adeguata.
- Perforare la bolla timpanica con un ago da 25 G ed espandere il foro secondo necessità con una pinza staccando l'osso all'indietro per consentire l'accesso al giro basale della coclea, quindi allargare sufficientemente per visualizzare l'arteria stapediale e la membrana della finestra rotonda (RWM).
- Perforare delicatamente l'RWM al centro con una pipetta capillare borosilicata. Osservare l'efflusso del fluido attraverso l'RWM a questo punto; Questo è normale. Attendere che l'efflusso si sia stabilizzato (il liquido efflusso dalla coclea viene asciugato con una carta da filtro sterile).
NOTA: Prestare attenzione quando si tiene e si fa avanzare l'ago di vetro in modo che la perforazione RWM sia la più piccola possibile. A seconda del microscopio utilizzato, tenere le pipette utilizzando un micromanipolatore o a mano utilizzando un portapipette. - Preparare le pipette per l'iniezione utilizzando un estrattore per pipette, allo stesso modo in cui vengono preparate le pipette patch clamp. Assicurarsi che il diametro del puntale sia grande (circa 15 μm di diametro) in modo che il pipettaggio del virus sia facile da eseguire.
- Aspirare da 1 a 2 μl di virus adeno-associati (AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP o AAV2-GFP) in una pipetta per iniezione. Dopo che l'efflusso si è stabilizzato (da 5 a 10 minuti), microiniettare questo volume fisso nella scala timpanica attraverso lo stesso foro precedentemente praticato in RWM.