Trapianto di cellule precursori di interneuroni di derivazione umana nell'ippocampo del cucciolo di topo

Abstract

Fonte: Gonzalez-Ramos, A., et. al., Trapianto di neuroni GABAergici derivati da cellule staminali umane nell'ippocampo di topo postnatale precoce per mitigare i disturbi dello sviluppo neurologico. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video mostra l'iniezione stereotassica di cellule precursori di interneuroni di derivazione umana nell'ippocampo di un cucciolo di topo geneticamente modificato con interneuroni inibitori ridotti, con l'obiettivo di ripristinare l'equilibrio eccitatorio-inibitorio.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Trapianto intraippocampale di cellule

NOTA: Tutti i passaggi di questa sezione vengono eseguiti al di fuori del cappuccio di coltura cellulare nella struttura per animali. Il trapianto postnatale precoce di cellule nel cervello è stato eseguito su P2, considerando P0 il giorno della nascita.

1. Preparati per l'esperimento di trapianto seguendo i passaggi seguenti.
   1. Autoclave tutto il materiale chirurgico o, se non possibile, sterilizzate con un altro metodo approvato.
   2. Montare la siringa per iniezione nel supporto senza alcun capillare di vetro. Sciacquare l'ago con acqua.
      NOTA: L'ago deve essere da 33 G.
   3. Curvare di 90° la punta di un ago da insulina da 30 G.
   4. Crea un palco simile a un Play-Doh fatto in casa per posizionare il cucciolo con la testa piatta (Figura 1A).
   5. Prendi la gabbia per topi con la madre e i cuccioli prima di preparare qualsiasi cosa per l'intervento chirurgico per consentire loro di acclimatarsi al nuovo ambiente.
   6. Prepara un vassoio con ghiaccio umido e una gabbia vuota con della carta per l'isoflurano.
2. Anestetizzare il cucciolo di topo.
   1. Immergi un pezzo di carta con isoflurano (vedi Tabella dei materiali) e mettilo all'interno della gabbia vuota. Prendi con cura un cucciolo e mettilo nella gabbia con la carta imbevuta di isoflurano.
      NOTA: Non lasciare mai meno di tre cuccioli con la mamma. Non superare i 20-30 secondi di anestesia con isoflurano, altrimenti il cucciolo potrebbe morire.
   2. Verificare l'effetto dell'anestesia mediante cessazione del movimento.
   3. Immediatamente dopo l'anestesia, posizionare il cucciolo su un fazzoletto umido sulla superficie del ghiaccio bagnato. Tenere l'animale sul ghiaccio per 3 minuti fino a quando gli arti superiori diventano biancastri (Figura 1B, freccia blu). Questo di solito richiede 2-3 minuti.
   4. Utilizzare questo tempo per caricare la siringa con la sospensione cellulare. Risospendere accuratamente le cellule con una pipetta prima.
   5. Posiziona il cucciolo sul telaio stereotassico. Utilizzare le barre auricolari nella direzione opposta (Figura 1A, frecce magenta).
      NOTA: Il lato posteriore delle barre auricolari è meno appuntito e, poiché i cuccioli P2 non hanno le orecchie, utilizzare il lato più piatto per evitare di ferire l'animale.
   6. Di lato, controlla se la testa è dritta. La testa deve essere piatta; usa il palco simile a Play-Doh per adattarti a questo.
      NOTA: I cuccioli a questa età non hanno ancora aperto gli occhi, quindi non è necessario prendere ulteriori misure al riguardo. I cuccioli non hanno pelo a questa età, quindi non è necessaria la rasatura dell'area. Non viene somministrato alcun trattamento specifico del dolore in quanto non si tratta di un'incisione aperta sulla pelle e non è coinvolta alcuna sutura.
   7. Tenere il cucciolo coperto di ghiaccio (sopra la carta velina) per tutta la durata dell'intervento.
      NOTA: Non mettere il ghiaccio a diretto contatto con la pelle del cucciolo.
3. Eseguire l'iniezione.
   1. Pulisci la superficie della pelle usando un panno morbido imbevuto di etanolo.
   2. Identificare lambda e impostare le coordinate a zero sulla console del display digitale dello strumento stereotassico (Figura 1C, linea tratteggiata gialla). Le suture sagittali e lambdoidi sono facilmente visibili all'occhio poiché sono vascolarizzate come linee rosse.
      NOTA: Se hai difficoltà a visualizzare lambda, metti un piccolo pezzo di ghiaccio sulla pelle e attendi un paio di minuti che si raffreddi. Quindi, rimuovi il pezzo di ghiaccio e il sottile sbiancamento della pelle ti permetterà di visualizzare.
   3. Riposizionare l'ago per iniezione alle coordinate desiderate. Nel protocollo descritto, la regione bersaglio era l'ippocampo e le coordinate erano le seguenti: antero-posteriore (AP) +0,85 e medio-laterale (ML) +1,35.
   4. Usa un ago da insulina piegato a 90° per penetrare nel cranio e creare un piccolo foro.
   5. Abbassare l'ago per iniezione fino a quando non ha attraversato il cranio e azzerare le coordinate dorso-ventrali (DV). Abbassare l'ago fino alle coordinate DV desiderate. Nel protocollo descritto, le coordinate erano DV −1.1.
   6. Iniettare secondo gli intervalli di tempo predeterminati.
      NOTA: Nel protocollo descritto, i tempi esatti erano i seguenti: (i) dopo essere scesi alla coordinata DV, attendere 3 minuti, (ii) iniettare 1 μL di volume per 5 minuti e (iii) dopo che tutto il volume è stato iniettato, attendere 3 minuti.
   7. Ritrarre lentamente l'ago.
4. Termina la procedura.
   NOTA: L'intervento chirurgico non può durare più di 15 minuti per garantire la sopravvivenza del cucciolo ed evitare qualsiasi danno derivato dall'anestesia per ipotermia.
   1. Riscalda il cucciolo con le mani fino a quando non inizia a muoversi prima di restituirlo alla madre.
   2. Somministrare DOX alla concentrazione di 1 mg/mL in soluzione di saccarosio allo 0,5% come acqua potabile per almeno 2 giorni prima e 3 settimane dopo il trapianto (PT) per continuare la differenziazione cellulare in vivo.

Results

Figura 1: Trapianto tereotassico S in cuccioli di topo appena nati a P2. (AUn palco simile a un Play-Doh viene utilizzato per tenere il corpo del cucciolo in posizione e inverte le barre auricolari (frecce ...

Materials