Trasferimento genico assistito da elettroporazione incorporato in agarosio nei progenitori degli interneuroni corticali di topo

Abstract

Fonte: Denaxa, M., el al., Trapianto di progenitori interneuronali corticali chemiogeneticamente modificati in cervelli di topo postnatali precoci. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra la procedura per iniettare un vettore plasmidico che trasporta il gene di interesse nei progenitori degli interneuroni in una fetta di cervello embrionale, seguita dall'elettroporazione per l'ingresso nel plasmide e l'espressione genica. Questi progenitori modificati possono essere successivamente utilizzati per il trattamento dei disturbi cerebrali.

Protocollo

1. Iniezioni focali di DNA
   1. Prepara una miscela di acido desossiribonucleico (DNA) di vettori di espressione: pCAGGs-IRES-GFP (vettore di controllo) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, a una concentrazione di 1 μg/μL per ogni vettore. Aggiungere la soluzione fast green (25 mg/mL) in una diluizione di 1/10.
   2. Riempire una micropipetta di vetro tirata (0,5 mm di diametro interno e 1 mm di diametro esterno) con 10 μL della miscela di DNA e iniettare piccole quantità (nell'intervallo 25-50 nL) nella regione selezionata (Eminenza gangliare mediale o MGE/Gangliare caudale o CGE) della fetta (Figura 1 e Figura 2).
2. Elettroporazione acuta
   NOTA: L'elettroporazione deve essere eseguita immediatamente dopo l'iniezione focale di DNA.
   1. Posiziona il piccolo blocco di agarosio sull'elettrodo della piastra di Petri e attacca la colonna di agarosio all'elettrodo di copertura mobile usando una micro-spatola a estremità piatta.
   2. Trasferire la fetta con la sua membrana di supporto sul blocco di agarosio e posizionare l'elettrodo superiore con la colonna di agarosio sopra la regione selezionata (MGE/CGE) della fetta.
      NOTA: Le tensioni di carica di 125 V (due impulsi di 5 ms ciascuno, intervallo 500 ms) produrranno un'elettroporazione riuscita (Figura 3).
3. Dopo l'elettroporazione, posizionare la fetta con la sua membrana di supporto nella piastra e trasferirla in un incubatore per colture tissutali di CO₂ a 37 °C.

Risultati

Figura 1: Fette telencefaliche rappresentative utilizzate per esperimenti di elettroporazione acuta. (A-C) Fette telencefaliche sono state ottenute a tre distinti livelli rostrocaudali sequenziali, colorate con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). LGE: emin...

Materiali