Trasferimento genico assistito da elettroporazione incorporato in agarosio nei progenitori degli interneuroni corticali di topo

1. Iniezioni focali di DNA
   1. Prepara una miscela di acido desossiribonucleico (DNA) di vettori di espressione: pCAGGs-IRES-GFP (vettore di controllo) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, a una concentrazione di 1 μg/μL per ogni vettore. Aggiungere la soluzione fast green (25 mg/mL) in una diluizione di 1/10.
   2. Riempire una micropipetta di vetro tirata (0,5 mm di diametro interno e 1 mm di diametro esterno) con 10 μL della miscela di DNA e iniettare piccole quantità (nell'intervallo 25-50 nL) nella regione selezionata (Eminenza gangliare mediale o MGE/Gangliare caudale o CGE) della fetta (Figura 1 e Figura 2).
2. Elettroporazione acuta
   NOTA: L'elettroporazione deve essere eseguita immediatamente dopo l'iniezione focale di DNA.
   1. Posiziona il piccolo blocco di agarosio sull'elettrodo della piastra di Petri e attacca la colonna di agarosio all'elettrodo di copertura mobile usando una micro-spatola a estremità piatta.
   2. Trasferire la fetta con la sua membrana di supporto sul blocco di agarosio e posizionare l'elettrodo superiore con la colonna di agarosio sopra la regione selezionata (MGE/CGE) della fetta.
      NOTA: Le tensioni di carica di 125 V (due impulsi di 5 ms ciascuno, intervallo 500 ms) produrranno un'elettroporazione riuscita (Figura 3).
3. Dopo l'elettroporazione, posizionare la fetta con la sua membrana di supporto nella piastra e trasferirla in un incubatore per colture tissutali di CO₂ a 37 °C.

Figura 1: Fette telencefaliche rappresentative utilizzate per esperimenti di elettroporazione acuta. (A-C) Fette telencefaliche sono state ottenute a tre distinti livelli rostrocaudali sequenziali, colorate con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). LGE: eminenza gangliare laterale; MGE: eminenza gangliare mediale; CGE: eminenza gangliare caudale. Barre di scala = 200 μm. Gli asterischi gialli indicano il sito di elettroporazione in ogni fetta. La linea bianca segna il bordo dell'eminenza gangliare.

Figura 2: Rappresentazione schematica del flusso di lavoro sperimentale. (A) Le fette di cervello di topo vengono elettroporate con costrutti appropriati e (B) dopo 12 ore, i precursori dell'interneurone corticale modificato (CI) vengono isolati e (C) trapiantati nel pallio di cuccioli di topo appena nati (P0-P2). Al fine di modificare l'attività degli IC immaturi, i cuccioli di P14 che avevano ricevuto trapianti di cellule sono stati iniettati con CNO o veicolo per quattro giorni costitutivi secondo il protocollo presentato. (A') Fotografia dell'impianto di elettroporazione acuta della fetta cerebrale di topo.

Figura 3: Esperimento rappresentativo di elettroporazione acuta a fette riuscito. (A) Sezione coronale rappresentativa di un embrione cerebrale E14.5 trasfettato nel CGE con plasmidi pCAGGs-IRES-GFP (Green fluorescent protein) e pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (Red fluorescent protein) e coltivato per 12 ore. La sezione è stata immunocolorata per GFP (A, B, C) e RFP (A, B, D). L'area del riquadro nel pannello A è ingrandita per mostrare l'espressione di entrambi i reporter fluorescenti (B), GFP (C) e solo RFP (D). La linea bianca segna il bordo dell'eminenza gangliare. B-D: stessa foto, canali diversi o una combinazione dei due canali diversi. Barre di scala = 200 μm (A), 100 μm (B-D).