Iniezione di vettori adeno-associati ricombinanti in un modello murino di atrofia muscolare spinale e bulbare

Abstract

Fonte:
Pourshafie, N., et al. Somministrazione sistemica di microRNA utilizzando il sierotipo 9 del virus adeno-associato ricombinante per il trattamento delle malattie neuromuscolari nei roditori. J. Vis. Exp. (2018).

In questo video, un topo affetto da atrofia muscolare spinale e bulbare o affetto da SBMA viene sottoposto a iniezione nella vena caudale di vettori AAV (vettori adeno-associati) ricombinanti che trasportano un microRNA terapeutico codificante un plasmide. Il vettore produce microRNA che si lega all'AR (recettore degli androgeni)-mRNA (acido ribonucleico messaggero) mutante, innescandone la degradazione. Questo riduce l'accumulo di proteine tossiche e aiuta a migliorare la funzione neuromuscolare.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Iniezione della vena caudale del plasmide AAV-miRNA

NOTA: Questo passaggio richiede un aggiustamento in base al gene bersaglio e all'età e al peso dei topi. Utilizzare le linee guida dell'Institutional and Animal Care and Use Committee (IACUC) per determinare l'intervallo di dosaggio, il volume e la migliore via di somministrazione in base all'età e al peso dei topi. Si prevede che il segnale di fluorescenza GFP (Green fluorescent protein) e i livelli di espressione dei miRNA nei tessuti bersaglio raggiungano il picco a partire da 2 settimane dopo l'iniezione. Il seguente protocollo si riferisce a topi maschi nella prima età adulta. L'AAV deve essere trattato come un rischio biologico secondo le linee guida di biosicurezza di livello 1.

1. Dividere lo stock di plasmidi AAV-miRNA in aliquote da 100-200 μL contenenti una carica virale di 10,^10-10,¹¹ genomi virali per mL (vg/mL) utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS). Per maneggiare la soluzione AAV è necessario utilizzare dispositivi di protezione individuale a rischio biologico da laboratorio.
   NOTA: Una volta scongelata, un'aliquota può essere conservata a 4 °C per un massimo di due settimane. Il brodo virale può essere conservato in congelatore a -80 °C.
2. Trattenere il topo in sistemi di ritenuta disponibili in commercio, come tubi di plastica o di pellicola di plastica affusolata di dimensioni adeguate.
3. Pulisci la superficie della coda con salviettine imbevute di alcol al 70%.
4. Tenere un tampone caldo (28-30 °C) sotto la coda per 30 secondi per aumentare la vasodilatazione. In alternativa, riscalda gli animali usando una lampada termica rossa (a una distanza di 2-3 piedi) o immergendo la coda in acqua tiepida.
5. Partendo dalla porzione distale della coda, inserire in vena l'ago (27-30 G) caricato con l'aliquota virale, smussare verso l'alto, a 15° dalla coda. Prima dell'iniezione, assicurarsi che l'ago sia inserito correttamente.
   1. Se si avverte resistenza durante l'iniezione o appare gonfiore sotto la pelle, interrompi la procedura. Rimuovere l'ago e reinserirlo sopra il sito di iniezione precedente.
      NOTA: In alternativa, ciò può essere ottenuto aspirando delicatamente l'ago e osservando il sangue. Una forte aspirazione può far collassare la vena caudale. Se la vena sbianca durante l'iniezione, l'ago è inserito correttamente.
6. Al termine dell'iniezione, attendere alcuni secondi prima di sollevare l'ago.
7. Osservare il sito di iniezione per verificare la presenza di sanguinamento. Applicare una pressione moderata con due dita sul sito fino a quando l'emorragia non si ferma.
8. Rimetti l'animale nella sua gabbia.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Scale	Pelouze	SP5
Nalgene secchio	Thermo Scientific	12014000	4000 mL
	USA Scientific	1615-5500
Ringer lattato. Soluzione	Baxter Healthcare	0338-0114-04
Mini vortexer	Fisher Scientific	128101
Centrifuga	Eppendorf	22624415
Film da laboratorio	Bemis	PM996
Siringa da 1 mL	BD	309626	Viene fornito con un ago da 25 g collegato. Sostituire con ago da 27-30 g per iniezione
Ago da 30 g	BD	305106
Isoflurano	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isoflurano USP 250 ml
Maschera per anestesia	Kopf Instruments	906
Garza	Henry Schein	100-2524	2" x 2" (5 cm x 5 cm)
Punte per pipette	USA Scientific	1111-0816
Micropipet	Gilson	4642080
Vaporizzatore per anestesia a gas	SurgiVet	4214322	Classic T3
Scavenger per anestesia a gas	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Cuscinetto riscaldante	Sears	17280
Cuscinetto da banco	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/ Harvard Apparatus	76-0772	4 ratti/ 4 topi 70
% etanolo	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 prova
70% Isopropanolo	VWR	89108-160

Provetta per microcentrifuga da