Iniezione intracranica di metaboliti microbici derivati dall'intestino in un modello murino

Abstract

Fonte: Liou, C. et al. Somministrazione intracerebroventricolare di metaboliti microbici di origine intestinale in topi che si muovono liberamente. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video mostra l'iniezione intracranica di acidi grassi a catena corta (SCFA) in un topo che si muove liberamente per studiarne gli effetti sul comportamento mediato dal cervello. Una cannula iniettiva viene inserita in una cannula guida impiantata nel cervello del topo. Dopo il recupero, il topo si acclimata in una nuova gabbia. Vengono quindi somministrati SCFA e viene registrato il comportamento locomotore.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione per l'animale da esperimento

1. Procurati topi maschi C57BL/6JNarl selvatici di 6-8 settimane da un venditore.
2. Ospita i topi in una gabbia per topi standard con cibo per topi standard e acqua sterilizzata ad libitum.
   NOTA: Le condizioni di stabulazione per il Laboratory Animal Center sono 22 ± 1 °C di temperatura, 55% ± 10% di umidità e un ciclo luce/buio di 13 ore/11 ore.

2. Chirurgia stereotassica

1. Preparare e sterilizzare lo strumento stereotassico, gli strumenti chirurgici e gli articoli correlati.
   NOTA: Tutti gli elementi che entreranno in contatto diretto con il sito chirurgico devono essere sterilizzati per evitare infezioni.
2. Anestetizzare il topo mettendolo nella gabbia di plexiglas con l'1%-5% di isoflurano in ossigeno.
   NOTA: Osservare attentamente il topo per assicurarsi che la frequenza respiratoria sia mantenuta a circa un respiro al secondo.
3. Estrarre il topo dalla camera di anestesia. Radere il sito chirurgico (testa del topo) con un rifinitore per animali domestici. Posizionare il mouse sulla cornice stereotassica fissando gli incisivi del topo sulla barra incisiva nel supporto per incisivi stereotassici. Copri il naso con la maschera a cono.
4. Anestetizzare il topo con isoflurano all'1%-2,5% in ossigeno durante l'intervento di chirurgia stereotassica. Valutare la nocicezione del topo attraverso il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi e garantire una frequenza respiratoria costante prima di incidere il sito chirurgico.
5. Posizionare un termoforo (37,0 °C) sotto il mouse sul telaio stereotassico per mantenere la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico. In alternativa, mantenere la temperatura interna con l'ausilio di una sonda termica rettale che collega lo scaldavivande programmato e il termoforo.
6. Rimuovere il pelo tagliato sulla testa usando del nastro adesivo. Iniettare nel topo l'analgesico Ketoprofene (5 mg/kg) per via sottocutanea per alleviare il dolore. Applicare un unguento per gli occhi per evitare la secchezza oculare.
7. Inserire la barra auricolare appuntita nel condotto uditivo per fissare la testa.
8. Centrare la testa regolando la scala della barra auricolare.
9. Stringere il morsetto nasale sul supporto dell'incisivo per evitare movimenti verticali. Premere delicatamente la testa per verificare che la testa sia fissata ed evitare che la testa si allenti durante l'intervento chirurgico successivo.
10. Disinfettare il cuoio capelluto con tre scrub alternati di clorexidina utilizzando un batuffolo di cotone. Inizia ogni scrub dal centro verso l'esterno (dall'area centrale più disinfettata all'area meno disinfettata).
    NOTA: L'uso di scrub dal centro verso l'esterno potrebbe aiutare gli scienziati a ridurre al minimo l'infezione e la contaminazione dal pelo. L'area esterna è vicina alla regione della testa non rasata, che ha ancora una grande quantità di pelo e non è facile da disinfettare a fondo.
11. Incidere il cuoio capelluto in modo anteriore/posteriore (<1 cm) utilizzando una lama chirurgica. Aprire l'incisione e pulire il cranio con un batuffolo di cotone tenuto da una pinza per microdissezione.
    NOTA: Le pinze per microdissezione, la lama chirurgica e i tamponi di cotone devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'intervento chirurgico. Durante il processo chirurgico, sterilizzare tutte le attrezzature chirurgiche utilizzando uno sterilizzatore a microsfere di vetro (150 °C) per almeno 5 secondi prima e dopo ogni animale. Preparare un becher sterilizzato per tenere la lama chirurgica e la pinza durante il processo chirurgico e tra gli animali.
12. Identifica il Bregma e il Lambda sul cranio. Utilizzare il Bregma come riferimento per individuare la regione di interesse.
    1. Opzionale: Monta il trapano stereotassico sul supporto del trapano stereotassico e usa la punta del trapano per indicare Bregma come riferimento. Sterilizzare il trapano stereotassico utilizzando lo sterilizzatore a microsfere di vetro (150 °C) per almeno 5 s.
13. Calibrare e allineare il piano orizzontale del cranio piatto nei piani sinistro/destro e anteriore/posteriore con Bregma/Lambda.
    NOTA: Se non su un piano orizzontale corretto, rimontare il mouse sullo strumento stereotassico.

3. Impianto di cannule guida commerciali personalizzate

1. Identificare ed etichettare la posizione del ventricolo laterale destro in base alle coordinate stereotassiche: Distanza da Bregma, anteriore/posteriore (A/P): 0,26 mm, mediale/laterale (M/L): -1,0 mm, dorsale/ventrale (D/V): -2,0 mm.
   NOTA: Le coordinate possono essere modificate in base alla regione di interesse. Le coordinate per il ventricolo laterale si basavano su topi adulti C57BL/6J con un intervallo di peso di 26-30 g.
2. Praticare un foro (diametro = 1,5 mm) attraverso il cranio nel sito etichettato utilizzando una fresa stereotassica per l'impianto di una cannula guida commerciale.
3. Praticare da due a quattro fori in più (diametro = 1,5 mm) sul cranio utilizzando un trapano stereotassico per il montaggio di viti in acciaio inossidabile.
   NOTA: Sterilizzare il trapano stereotassico utilizzando uno sterilizzatore a perle di vetro (150 °C) per almeno 5 s prima e dopo ogni animale.
4. Pulisci i frammenti ossei e ferma l'emorragia con un batuffolo di cotone.
5. Pulisci il cranio con lidocaina (1 mg/kg) usando un batuffolo di cotone per effetti anestetici locali, antipruriginosi e antidolorifici. Se il sanguinamento non si ferma dopo la perforazione, posizionare delicatamente un batuffolo di cotone sul foro per l'emostasi.
6. Montare da due a quattro viti in acciaio inossidabile sui fori per fornire ancoraggi per acrilico dentale.
7. Posizionare la cannula guida commerciale sul supporto della cannula stereotassica e disinfettarla con lo sterilizzatore a microsfere di vetro (150 °C).
   NOTA: La cannula guida commerciale, il manichino commerciale e l'iniettore commerciale (Figura 1A) sono stati personalizzati con le specifiche riportate nella Tabella dei materiali.
8. Spostare il supporto della cannula stereotassica nel foro praticato per il ventricolo laterale e inserire lentamente la cannula guida commerciale nel foro fino alla profondità desiderata (2,5 mm).
   NOTA: La coordinata dorsale/ventrale può essere definita impostando la punta della cannula guida commerciale come riferimento quando la punta è appena inserita nel foro.
9. Applicare 10 μl di adesivo cianoacrilato n-butilico (colla adesiva per tessuti) per fissare la cannula guida commerciale nel foro praticato e attendere 3-4 minuti. Rilasciare delicatamente la cannula guida commerciale dal supporto della cannula stereotassica e allontanare il supporto.
10. Applicare l'acrilico dentale sul cuoio capelluto inciso per fissare la cannula guida commerciale e attendere almeno 5 minuti. Impiantare il manichino commerciale nella cannula guida commerciale per evitare l'ostruzione della cannula da parte del sangue o del fluido corporeo (Figura 1B).
11. Rilasciare la barra auricolare dal condotto uditivo e rimuovere il mouse dalla cornice stereotassica.
12. Posiziona il mouse in una nuova gabbia con un termoforo sottostante per il recupero dall'anestesia e osserva continuamente fino a quando il mouse non si risveglia completamente.
    NOTA: Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Un animale che ha subito un intervento chirurgico non dovrebbe tornare in compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
13. Riportare il topo in stabulazione singola o in gruppo, a seconda del protocollo del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) e del disegno sperimentale. Per la stabulazione in gruppo, assicurarsi che un minor numero di topi sia alloggiato in una gabbia per ridurre al minimo le lesioni indesiderate o il distacco della cannula.
14. Somministrare ibuprofene (0,2 mg/mL) nell'acqua potabile per almeno 3 giorni per le cure postoperatorie e monitorare due volte al giorno per segni di dolore e angoscia per almeno 3 giorni.
    1. Durante la cura postoperatoria, applica unguento alla roxitromicina intorno alla pelle per prevenire l'infiammazione e l'infezione nei topi.
    2. Continua a monitorare lo stato dell'animale e fai un'iniezione intraperitoneale tempestiva di glucosio al 5% e/o cloruro di sodio allo 0,9% per fornire energia sufficiente.
    3. Se lo stato di dolore, angoscia o infezione peggiora costantemente, sopprimere il topo per inalazione di CO₂.
15. Attendere 1 settimana dopo l'operazione affinché il topo sia pronto per la somministrazione intracerebroventricolare di acidi grassi a catena corta (SCFA) e per i test comportamentali.

4. Preparazione degli SCFA

1. Sciogliere l'acetato di sodio, il butirrato di sodio e il propionato di sodio nel liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) (vedere la Tabella dei materiali).
2. Assicurarsi che le sostanze chimiche siano completamente disciolte, quindi regolare il pH a 7,4 e filtrare la miscela di SCFA attraverso un filtro da 0,22 μm per la sterilizzazione.

5. Impostare il sistema di infusione per la somministrazione intracerebroventricolare di SCFA durante i test comportamentali

1. Montare una telecamera a soffitto per registrare il comportamento. Collegare la fotocamera a un computer per controllare il software di registrazione video (Figura 2).
2. Riempire una siringa da 10 μl con acqua distillata.
   NOTA: Evitare bolle d'aria nella siringa da microlitro.
3. Collegare una pompa di microiniezione con il controller di microiniezione.
4. Montare la siringa da microlitro sulla pompa di microiniezione. Per installare la siringa, premere il pulsante per allentare il morsetto e installare la siringa nella posizione corrispondente. Chiudere il morsetto e serrare la vite di fissaggio dello stantuffo sulla pompa di microiniezione (Figura 3A).
5. Inserire l'iniettore commerciale nel tubo di polietilene (Figura 1A).
6. Appendere il tubo di polietilene alla telecamera a soffitto sopra l'arena di prova.
7. Riempire il tubo di polietilene con acqua distillata utilizzando una siringa da insulina. Collegare la siringa da microlitro al tubo di polietilene sospeso.
   NOTA: Assicurarsi che il tubo in polietilene sia sufficientemente lungo da consentire al mouse di muoversi liberamente nell'arena di test.

6. Impostazioni di sistema del controller di microiniezione

1. Accendere il controller di microiniezione e premere Display All Channels per accedere alla schermata di comando (Figura 3C). Premere Configurazione e impostare il volume target su 9.800 nL con la velocità di erogazione su 100 nL/s. Infondere 9.800 nL di acqua distillata dal tubo di polietilene collegato alla siringa da microlitro (premere Direzione per passare alla modalità Infuse e premere RUN) (vedere i quadrati rossi nella schermata di comando della Figura 3C).
2. Premere Configurazione e impostare Volume Target su 3.000 nL con Velocità di erogazione su 100 nL/s. Prelevare 3.000 nL di olio minerale (premere Direzione per passare alla modalità di prelievo e premere RUN) (vedere i quadrati rossi nella schermata di comando della Figura 3C).
   NOTA: Sul tubo di polietilene deve essere osservata una chiara separazione di fase olio-acqua.
3. Smontare il tubo di polietilene dall'ago della siringa da microlitro. Sputare 3.000 nL di acqua distillata dall'ago della siringa da microlitro (premere Direzione per passare alla modalità Infuse e premere RUN).
4. Reinserire la siringa da microlitro nel tubo di polietilene. Premere Configurazione e impostare il volume target su 9.500 nL con una velocità di erogazione di 100 nL/s. Prelevare 9.500 nL di SCFA (premere Direzione per passare alla modalità di prelievo e premere RUN). Etichettare la fase olio-SCFA per verificare se gli SCFA sono stati infusi correttamente.
5. Premere Configurazione e impostare l'obiettivo di volume desiderato con la velocità di erogazione su 7 nL/s. Premere Direzione per passare alla modalità Infuso (vedere i quadrati rossi nella schermata di comando della Figura 3C).
   NOTA: Determinare il volume in base al tempo di infusione. Ad esempio, se il tempo di infusione è di 3 minuti per una velocità di erogazione di 7 nL/s, volume target = 1.260 nL.
6. Premere RUN per infondere la siringa da microlitro in avanti fino a quando il liquido non fuoriesce dall'estremità anteriore dell'iniettore commerciale prima di inserire l'iniettore nella cannula per l'iniezione di SCFA.

7. Infusione di SCFA nel ventricolo laterale attraverso la cannula guida commerciale in un topo che si muove liberamente

1. Anestetizzare il topo posizionandolo nella gabbia di plexiglas con isoflurano all'1%-5% in ossigeno.
   NOTA: Osservare attentamente il topo per assicurarsi che la frequenza respiratoria sia mantenuta a circa un respiro al secondo.
2. Collottola il mouse e inserire l'iniettore commerciale nella cannula guida commerciale (Figura 3B).
   NOTA: Se la cannula guida commerciale è ostruita da sangue o fluido corporeo, sbloccarla delicatamente con una pinzetta.
3. Lasciare che il topo si riprenda dall'anestesia per 15 minuti in una gabbia prima del test comportamentale.
4. Per il test di locomozione di base, posizionare il topo in una nuova gabbia e lasciarlo esplorare liberamente per 35 minuti. Infondere SCFA utilizzando una velocità di consegna di 7 nL/s per un volume target di 2.100 nL nei primi 5 minuti (premere Direzione per la modalità Infuse e premere RUN).
   NOTA: La locomozione nella nuova gabbia può essere analizzata utilizzando il software di tracciamento video del comportamento animale.
5. Anestetizzare il mouse (ripetendo il passaggio 7.1) e rimuovere l'iniettore commerciale dalla cannula guida commerciale.
   NOTA: Il topo può essere iniettato ripetutamente con diversi controlli/metaboliti dopo aver dato il periodo di tempo appropriato per lavare via l'iniezione precedente. Finché la cannula è fissata sulla testa del topo, il topo può essere testato ripetutamente con diversi metaboliti.

8. Ripristino del sistema di microiniezione

1. Smontare il tubo di polietilene dalla siringa da microlitro.
2. Iniettare aria nel tubo utilizzando la siringa da insulina per eliminare l'acqua distillata nel tubo di polietilene. Svuotare la siringa da microlitro.
3. Premere Ripristina posizione nella schermata di configurazione per aprire la schermata di definizione della figura di arresto della siringa (Figura 3C).
4. Premere Ritira finché non viene emesso un segnale acustico per riportare la pompa di microiniezione in posizione completamente estratta (Figura 3C).
5. Tornare alla schermata dei comandi e spegnere il controller di microiniezione se su questa schermata è presente il segno **FINE RAGGIUNGITA** (Figura 3C).

Risultati

Figura 1: Impianto della cannula guida commerciale nei topi. (A) L'immagine rappresentativa di una cannula guida, di un manichino e di un iniettore commerciali. (B) L'immagine rappresentativa di una cannula guida commerciale e di un manichin...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofene A2:D41	Pfizer	n/a
Filtro sottovuoto per bottiglie, 500 mL, 0.22 μm, PES,	NEST	sterile121921LA01
CaCl₂	Sigma-Aldrich	C1016	ACSF: 0,14 g/L
Scrub alla clorexidina 2%	Phoenix	NDC 57319-611-09
Soluzione di clorexidina	Phoenix	NDC 57319-599-09
Manichino commerciale	RWD Life Science	62004	Single_OD 0,20 mm/ M3,5/G = 0,5 mm
Cannul guida commerciale	RWD Life Science	62104	Single_OD 0,41 mm-27G/ M3,5/C = 2,5 mm
Iniettore commerciale	RWD Life Science	62204	Single_OD 0,21 mm-33G/ Si accoppia con M3,5/C = 3,5 mm/G = 0,5 mm
D-(+)-Glucosio	Sigma-Aldrich	G8270	ACSF: 0,61 g/L
Acrilico dentale	HYGENIC	n/a
Viti di fissaggio	RWD Life Science	62521
Siero di cavallo	ThermoFisher Scientific	16050130
Siringhe per insulina	BBraun	XG-LBB-9151133S-1BX	1 mL
di isoflurano	Panion & BF biotech	DG-4900-250D
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	ACSF: 0,19 g/L
Ketoprofene	Swiss Pharmaceutical	n/a
Lidocaina	AstraZeneca	n/a
Agarosio a basso punto di fusione	Invitrogen	16520
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M8266	ACSF: 0,19 g/L
Vetrini per microscopio	ThermoFisher Scientific	4951PLUS-001E
Olio minerale leggero, bianco NF	Macron Fine Chemicals	MA-6358-04
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	ACSF: 7,46 g/L
NaH₂PO₄	Sigma-Aldrich	S8282	ACSF: 0,18 g/L
NaHCO₃	Sigma-Aldrich	S5761	ACSF: 1,76 g/L
di adesivo n-butil cianoacrilato (colla adesiva tissutale)	3M	1469SB	3M Vetbond
Neural tracer	Santa Cruz	SC-358883	FluoroGold
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148
Tubo in polietilene	RWD Life Science	62329	OD 1.50, I.D 0.50 mm e OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (occhio) Unguento	Dechra	12920060
Acetato di sodio	Sigma-Aldrich	S2889	SCFAs: 13.5 mM
Sodio azide	Sigma-Aldrich	S2002
Butirrato di sodio	Sigma-Aldrich	B5887	SCFA: 8 mM
Propionato di sodio	Sigma-Aldrich	P1880	SCFA: 5,18 mM
Cannula guida in acciaio inossidabile	Chun Ta impresa CO., LTD.	n/a	OD 0,63 mm; Fornitore locale
Iniettore in acciaio inossidabile	Chun Ta impresa in acciaio inossidabile CO., LTD.	n/a	OD 0,3 mm; il manichino è costituito da iniettore; fornitore locale
Supercolla	Krazy Colla	KG94548R
Triton X-100	Merck	1.08603.1000
Attrezzatura
Supporto per cannula	RWD Life Science	B485-68217
Telecamera da soffitto	FOSCAM	R2
Strumenti stereotassici digitali	Stoelting	51730D
Microscopio da dissezione	INNOVIEW	SEM-HT/TW
Sterilizzatore a perline di vetro	RWD Life Science	RS1501
Termoforo	Stoelting	53800M
Micro pinza da dissezione	ROBOZ	RS-5136	seghettata, leggera curva; Extra delicato; Larghezza della punta di 0,5 mm;
Forbici per microdissezione	ROBOZ	RS-5918	affilata angolata da 4,5"
	World Precision Instruments (WPI)	MICRO2T	Controller SMARTouch
Pompa a siringa per microiniezione	World Precision Instruments (WPI)	UMP3T-1	UltraMicroPumpSiringa
da 3 microlitri	Hamilton	80014	10 μL
Fibra ottica Luce fredda con doppia fibra Step		LGY-150	Fornitore locale
Tagliabordi per animali domestici	WAHL	09962-2018
Software
Software di tracciamento video del comportamento animale	Noldus	EthoVision	Versione: 15.0.1416

da 4" Controller per microiniezione