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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione degli animali
Nota: gli animali che devono subire lesioni leggere richiedono un adattamento al buio la notte prima dell'ischemia remota. Gli animali che subiscono danni da luce richiedono un allevamento al buio (12 ore di luce: ciclo di buio, 5 lux)
- Eseguire l'ischemia a distanza in roditori svegli o anestetizzati. Assicurati che gli animali abbiano un tono muscolare sano. Assicurati che ciò accada pizzicando l'arto posteriore superiore per confermare che sia presente un muscolo adeguato. La protezione indotta da RIP contro le lesioni leggere è stata testata in ratti sedentari fino a 6 mesi di età.
- Preparazione anestetizzata per il precondizionamento ischemico remoto (RIP)
- Iniettare nei ratti un'iniezione intraperitoneale di 60 mg/kg di ketamina e 5 mg/kg di xilazina. Controllare la profondità dell'anestesia estendendo la gamba e pizzicando la pelle sul lato inferiore del piede. L'animale non ha riflessi se è profondamente anestetizzato. Applicare lacrime artificiali per evitare la secchezza corneale durante l'anestesia.
- Posizionare i ratti su un termoforo o su un tubo dello scaldabagno a circolazione per mantenere una temperatura corporea costante di 37,5 °C. Posizionare il ratto in posizione prona con i poggiapiedi degli arti inferiori rivolti verso l'alto. L'arto destro o sinistro può andare incontro a ischemia remota.
2. Applicazione della sonda di temperatura cutanea
- Estendere la zampa del ratto che deve essere sottoposto a ischemia e posizionare la sonda cutanea sulla pedana. Posizionare la sonda cutanea in modo da massimizzare il contatto tra la sonda di temperatura e la pelle. Spingere con decisione la sonda nel poggiapiedi e fissare la sonda con del nastro di carta.
- Controllare il posizionamento della sonda cutanea monitorando la temperatura sul software di registrazione della temperatura. Assicurarsi che la temperatura della pelle sia compresa tra 30 e 34 °C e rimanga stabile. Monitorare la temperatura della pelle per 1-2 minuti. Regolare la sonda cutanea se la temperatura è instabile o inferiore a 30 °C.
3. Ischemia remota
- Sgonfiare il bracciale e assicurarsi che la valvola di pressione dell'aria sia chiusa. Estendi la gamba e circonda liberamente il polsino sull'arto posteriore superiore. Usa l'indice e il pollice per estendere la gamba e le dita inferiori per mantenere in posizione il polsino allentato.
- Aumentare la pressione del bracciale dell'animale anestetizzato a 160 mmHg e, negli animali svegli, aumentare la pressione del bracciale a 180 mmHg.
Nota: la pressione sanguigna anestetizzata dei ratti varia da 120 a 140 mmHg e sale a 160 mmHg quando coscienti. Avviare le registrazioni del timer e della temperatura del piede una volta raggiunta la pressione corretta.
Nota: la temperatura del piede dovrebbe scendere di 2 °C dopo 5 minuti di pressione costante. - Mantenere la posizione del bracciale sopra il "ginocchio" dell'animale durante l'ischemia. La pressione del bracciale inizierà a diminuire dopo pochi minuti o se l'arto del ratto si muove.
- Pompare ripetutamente il bulbo di gonfiaggio in brevi raffiche per mantenere la pressione desiderata del bracciale Brevi raffiche ripetitive di pompaggio
- L'ischemia remota può essere erogata continuamente per un periodo compreso tra 5 e 15 minuti. Il protocollo di riperfusione ischemica comprende 2 periodi di ischemia di 5 minuti con una riperfusione intermedia di 5 minuti.
- Sgonfiare la pressione del bracciale allentando la valvola di pressione dell'aria. Controllare la variazione di temperatura nel corso del protocollo di ischemia. Rilasciare il bracciale.
- Continua con la sperimentazione degli infortuni. Gli animali sotto l'effetto dell'anestesia dovranno essere posizionati su un cuscinetto termico. Continuare a monitorare gli animali fino all'ambulatorio. Gli animali non possono essere restituiti all'alloggio fino a quando non camminano.