Condotti con semina cellulare di Schwann per la rigenerazione assonale dopo una lesione del midollo spinale

In questo articolo

Abstract

Fonte: Lee, Y., et.al. Trapianto di cellule di Schwann all'interno di condotti PVDF-TrFE per colmare i monconi del midollo spinale di ratto transetto per promuovere la rigenerazione degli assoni attraverso il divario. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra l'uso di un condotto polimerico piezoelettrico seminato con cellule di Schwann per promuovere la rigenerazione degli assoni in un midollo spinale di ratto sezionato. Il condotto fornisce una guida strutturale, mentre le sue proprietà bioelettriche stimolano la crescita dei neuriti. Le cellule di Schwann all'interno del condotto secernono fattori neurotrofici, supportando il ponte assonale tra i monconi rostrale e caudale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Trassezione a T8

Posiziona il divaricatore da T7 a T9. Una volta rimosse tutte le lamine, assicurarsi che gli spazi tra i processi trasversali siano visibili, soprattutto a T8. Esaminare anche le ossa lungo la lunghezza su entrambi i lati tra T7 e T9 per assicurarsi che non ci siano frammenti ossei che sporgono verso l'esterno.
NOTA: Questo spazio in T8 è importante per eseguire la transezione completa. Le vertebre lungo la lunghezza devono essere rimosse per facilitare l'inserimento del condotto.
Tagliare le radici dorsali e ventrali sopra e sotto T8 usando le forbici a molla angolate. Aggiungere soluzione salina al midollo spinale e attendere che il sangue si coaguli.
NOTA: Questo passaggio è importante per il corretto inserimento del condotto.
Posiziona le forbici a molla angolate sopra il midollo spinale negli spazi tra i processi trasversali a T8 e fai un taglio per recidere completamente il midollo spinale. Posizionare un piccolo pezzo di schiuma compressa nello spazio risultante di 2-2,5 mm e aggiungere immediatamente soluzione salina all'area.

2. Inserimento del condotto

Mentre aspetti che i monconi del cordone reciso raggiungano l'emostasi, estrai un condotto da 1x PBS. Tagliare i triangoli di assorbimento in pezzi sottili e lunghi e inserirli nel condotto per rimuovere il PBS in eccesso. Verificare che le finestre pretagliate siano aperte.
Rimuovere la soluzione salina e il sangue utilizzando pezzi lunghi e sottili di triangoli di assorbimento. Sollevare i due monconi del midollo spinale utilizzando una microspatola per garantire una buona separazione. Sollevare delicatamente il moncone rostrale con la microspatola e far scivolare il condotto sopra il moncone con le finestre rivolte verso l'esterno. Assicurarsi che l'intero moncone sia inserito e che non vi sia un eccesso di sanguinamento nel condotto.
Sollevare delicatamente il moncone caudale e far scivolare l'altra estremità del condotto sopra il moncone. Assicurarsi che l'intero moncone sia inserito e che le finestre siano sulla superficie dorsale (Figura 1A).

3. Preparazione e iniezione di cellule di Schwann (SC)/ matrice iniettabile

In attesa che il cordone mozzato raggiunga l'emostasi, rimuovere il terreno sopra il pellet GFP-SC. Risospendere i GFP-SC in 10 μl di DMEM/F12 freddo. Aggiungere 10 μl di gel iniettabile a freddo alla sospensione cellulare e mescolare bene mediante pipettaggio ripetuto. Conservare la miscela GFP-SC/DMEM/F12/matrice iniettabile sul ghiaccio fino al completamento dell'inserimento del condotto.
Dopo essersi assicurati che le finestre sulla superficie dorsale siano aperte (Figura 1A), iniettare 20 μl della miscela GFP-SC/DMEM/F12/matrice iniettabile nel condotto attraverso una delle finestre pretagliate utilizzando un puntale di caricamento Western Blot e una micropipetta. Se la miscela SC/DMEM/F12/matrice iniettabile dovesse riempire eccessivamente il condotto, rimuovere l'eccesso con triangoli di assorbimento. Chiudere le finestre dopo l'iniezione; la sutura non è necessaria (Figura 1B).

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Risultati

Figura 1: Chiusura della finestra dopo l'iniezione di SC/DMEM/F12/matrix. Le finestre si aprono ripiegando ogni lembo dopo aver posizionato il condotto tra i monconi rostrali e caudali (A). Le finestre vengono chiuse dopo l'i...