Rilascio di un colorante fluorescente nello spazio sottoretinico di un topo

Abstract

Fonte: Parikh, S., et al. Un metodo di iniezione alternativo e convalidato per l'accesso allo spazio sottoretinico tramite un approccio posteriore transclerale. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra la procedura per l'erogazione di un colorante fluorescente nello spazio sottoretinico di un topo. Il processo prevede l'anestetizzazione del topo, la preparazione dell'occhio, l'esecuzione di incisioni precise per accedere allo spazio sottoretinico e l'iniezione del colorante per creare un distacco di retina controllato. Questa tecnica consente la somministrazione mirata del colorante, consentendo l'imaging e l'analisi dettagliati delle strutture retiniche.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

Animali: Topi selvatici C57Bl/6J allevati presso l'Università della California a Los Angeles (UCLA). Tutti gli animali avevano un'età compresa tra le 11 e le 17 settimane e includevano topi maschi e femmine. Tutti i topi sono stati alloggiati in gruppo, mantenuti in un ciclo luce/buio 12:12 con cibo e acqua ad libitum.

NOTA: Tutti i farmaci e gli agenti iniettabili sono di grado USP (United States Pharmacopeia).

1. Preparazione chirurgica

1. Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di ketamina e 8 mg/kg di xilazina in una miscela salina. Somministrare l'anestesia a una profondità tale che il topo non abbia pizzicamento delle dita dei piedi o riflessi tattili corneali.
2. Mantenere la temperatura corporea a 37,0 °C con un tampone di ricircolo dell'acqua.
3. Dilata le pupille con un collirio al 2,5% di fenilefrina e taglia i baffi per facilitare la visualizzazione. I baffi forniscono un input sensoriale significativo al topo; Pertanto, il taglio dei baffi dovrebbe rimuovere solo la parte che blocca il libero accesso all'occhio e non alla base dei baffi. Nella nostra esperienza, i topi mostrano un recupero normale dopo questa procedura. Applicare colliri di metilcellulosa per prevenire la secchezza e ridurre al minimo la cataratta transitoria indotta dall'anestesia.
4. Sterilizzare gli strumenti prima dell'intervento chirurgico (ad es. betadina ed etanolo o perline calde).
5. Preparare la fluoresceina diluita (0,01% utilizzando soluzione fisiologica allo 0,9%) in un ambiente sterile (ad es. cabina di biosicurezza) se verrà eseguita la visualizzazione (vedere la sezione 3 di seguito).

2. Preparazione del sito di iniezione

1. Preparare una siringa (ad es. siringa da 5 μl) con il volume di iniezione appropriato (ad es. da 0,3 a 1,0 μl).
2. Posizionare il mouse in modo che l'occhio sia rivolto verso l'alto e chiaramente visibile nel microscopio da dissezione.
3. Pizzicare delicatamente la congiuntiva temporale con una pinza a punta fine. Praticare un'incisione circonferenziale di circa 90 gradi utilizzando le forbici curve di Vannas.
4. Ripetere il passaggio 2.3 con la capsula di Tenone sottostante.
5. Resecare il tessuto connettivo circostante con una pinza a punta fine mentre si ruota il globo nasale. Lavorare verso il sito di iniezione a circa 0,5 mm di distanza dal nervo ottico. Prestare molta attenzione per evitare di interrompere il seno retro-orbitale.

3. Sclerotomia e iniezione sottoretinica

NOTA: Si raccomanda di utilizzare l'iniezione di fluoresceina allo 0,01% in soluzione salina allo 0,9% per facilitare la visualizzazione durante l'apprendimento di questa procedura. La distribuzione topografica della fluoresceina può essere efficacemente documentata con l'imaging del fondo oculare (vedere la sezione 4 di seguito).

1. Praticare una piccola incisione sclerale nel sito di iniezione grattando delicatamente l'oculare con una lama oftalmica di 22,5 gradi. Questa incisione dovrebbe essere abbastanza grande da consentire alla punta dell'ago di passare attraverso la sclera.
2. Inserire l'ago smussato da 33 G (angolato di 5 - 10° nella sclerotomia con lo smusso rivolto verso l'alto e angolato parallelamente alla retina. Iniettare il volume desiderato (ad es. da 0,3 a 1,0 μl di fluoresceina allo 0,01% per scopi di apprendimento).
   NOTA: Mantenere la sterilità della siringa pulendo accuratamente con lavaggi successivi di un solvente adatto e acqua deionizzata prima di ogni iniezione.
3. Premere lentamente lo stantuffo (oltre ~ 3 sec) senza muovere l'ago e con una pressione uniforme.
   NOTA: Quando l'ago si trova nello spazio sottoretinico, si avvertirà una leggera resistenza mentre si preme lo stantuffo. Ci sarà una resistenza minima o nulla se l'ago perfora la retina e un'elevata resistenza se l'ago non penetra nella sclera o nell'epitelio pigmentato retinico (RPE).
4. Attendere alcuni secondi prima di estrarre l'ago per ridurre al minimo il riflusso.
5. Sciacquare l'occhio con soluzione fisiologica tamponata sterile e assicurarsi che l'occhio sia tornato alla sua posizione normale.

4. Valutazione del distacco della retina mediante tomografia a coerenza ottica (OCT) e imaging del fondo

1. oculare Eseguire l'imaging OCT immediatamente dopo l'iniezione per valutare la qualità dell'iniezione e nei momenti appropriati dopo l'iniezione secondo necessità per valutare la struttura retinica.
   1. Regolare e allineare l'immagine OCT per individuare il sito di iniezione. Il sito di iniezione deve essere della linea mediana e di 0,5 mm di distanza rispetto alla testa del nervo ottico. Ripetere se necessario se il distacco è fuori dall'inquadratura o non è centrato in modo ottimale.
2. Visualizza il distacco della retina e l'area di iniezione del colorante con l'imaging del fondo oculare en-face.
   NOTA: Se non è disponibile un sistema di imaging OCT, l'iniezione di una piccola quantità di fluoresceina con un vettore per esercitarsi consentirà la visualizzazione con qualsiasi telecamera del fondo oculare che esegue l'angiografia con fluoresceina utilizzando le stesse lunghezze d'onda di eccitazione e filtri di blocco. Aree localizzate di iperfluorescenza appariranno sotto il sistema vascolare e il sistema vascolare avrà confini netti e distinti se lo spazio sottoretinico è mirato correttamente. Il bordo della bolla dall'iniezione sarà delimitato dalla transizione dall'iperfluorescenza all'ipofluorescenza. Diversi strumenti forniscono questa capacità per il mouse; La strumentazione qui utilizzata è descritta altrove.

5. Cura post-operatoria

1. Applicare uno strato spesso di crema oftalmica tripla antibiotica sulla superficie corneale dell'occhio iniettato.
2. Metti i topi in gabbie solitarie pulite per il recupero. Non combinare topi che hanno subito un intervento chirurgico fino a quando non si sono completamente ripresi.
3. Monitorare la respirazione e la temperatura durante il recupero in anestesia. Monitorare gli animali fino a quando non riescono a mantenere la decubito sternale.
4. Eseguire un ulteriore monitoraggio e trattamento post-operatorio appropriato, inclusa un'iniezione sottocutanea di carprofene (5 mg/kg) per la gestione del dolore post-chirurgico.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Siringa x 1
ago Hamilton 33 G, 1.0", 20 DEG, punto 3 (acciaio inossidabile 304)	Hamilton	7803-05	Aghi x 6
forbici curve Vannas	Ted Pella, INC.	1347	Lama da 5 mm
Coltello per microchirurgia da 22,5 gradi	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
Ketaject	Phoenix	NDC 57319-609-02	Ketamina
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Xilazina
Fluoresceina 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 mg/ml
0,9% Soluzione salina USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0,9% NaCl
Unguento antibiotico	Akorn	NDC 17478-235-35
Pompa di circolazione dell'acqua	Gaymar	TP-500 T / Pompa	P/N 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	R-Series	Telecamera
commerciale per fondi macchina Phoenix	Research Laboratories	Pinzette MICRON III
Tipo 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2,5% Fenilefrina	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15
Ipromellosa oftalmica 2,5%	Goniovisc	AX0401	Gocce
oculari di metilcellulosa (risciacquo)	Bausch & Lomb		Soluzione salina
Microscopio	Zeiss	Stemi 2000	Microscopio
Sorgente luminosa	Fostec	P/N 20520	Sorgente luminosa

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