Induzione optogenetica della depressione a lungo termine per sopprimere il comportamento di ricerca di stupefacenti nei ratti

Abstract

Fonte: Rich, M. T., et al. Utilizzo dell'optogenetica per invertire la neuroplasticità e inibire la ricerca di cocaina nei ratti. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video dimostra l'uso dell'optogenetica per indurre la depressione a lungo termine (LTD) nelle sinapsi del nucleo genicolato mediale all'amigdala laterale (MGN-LA), indebolendo il comportamento di ricerca di narcotici indotto da indizi in un modello di ratto. Il ratto, impiantato chirurgicamente con fibre ottiche e trasdotto viralmente per esprimere canali ionici sensibili alla luce, viene sottoposto a stimolazione optogenetica con impulsi ottici a bassa frequenza, innescando il rilascio di neurotrasmettitori e l'indebolimento sinaptico. Questo processo riduce la trasmissione sinaptica di MGN-LA attraverso l'internalizzazione del recettore dei neurotrasmettitori, interrompendo in ultima analisi l'associazione tra segnali e comportamento di ricerca di farmaci.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Cateterismo endovenoso per roditori, somministrazione di virus e impianto di fibre ottiche

1. Prepara gli animali per l'intervento chirurgico.
   1. Anestetizzare completamente i ratti con l'anestetico di scelta in base alle linee guida istituzionali. Un'opzione è la ketamina cloridrato (87,5-100 mg/kg, intramuscolare [i.m.]) e la xilazina cloridrato (5 mg/kg, i.m.). Assicurarsi che il ratto sia completamente anestetizzato controllando la mancanza di un riflesso di pizzicamento del dito del piede.
      ATTENZIONE: La ketamina è una sostanza controllata che deve essere maneggiata secondo le linee guida istituzionali.
      NOTA: In questo studio vengono utilizzate iniezioni intramuscolari di anestetici in quanto producono un'induzione anestesiologica più rapida e affidabile rispetto all'iniezione intraperitoneale. Monitorare continuamente la respirazione e la reattività del ratto e fornire supporto termico durante l'intervento chirurgico.
   2. Radere un'ampia area della schiena del ratto (parte superiore della schiena da appena sopra le scapole al centro della schiena) così come l'area del collo sotto l'arto anteriore destro e il cuoio capelluto.
   3. Posiziona il ratto nell'area chirurgica e applica il puralube (lacrime artificiali) sugli occhi. Iniettare un volume corporeo di carprofene (analgesico) per via sottocutanea (sottocutanea [s.c.]) attraverso la pelle della parte superiore della schiena, quindi iniettare 5 ml di soluzione di Ringer lattato s.c. attraverso la pelle della parte bassa della schiena.
   4. Igienizzare tutti i siti chirurgici bagnando un pezzo di garza sterile con betadine e strofinandolo lungo l'area chirurgica rasata con un movimento circolare. Quindi ripetere il processo con etanolo al 70%. Ripetere questo ciclo alternato tre volte.
2. Eseguire l'impianto di catetere endovenoso secondo i protocolli precedentemente pubblicati.
   NOTA: Durante questo intervento non viene utilizzato un telo chirurgico per evitare irritazioni durante l'impianto di catetere. Sterilizzare tutti gli strumenti e le attrezzature prima dell'uso. Utilizzare guanti sterili e sostituire i guanti in caso di contatto con una superficie non sterile.
3. Immediatamente dopo l'impianto del catetere, fissare il ratto in un telaio stereotassico per eseguire iniezioni di virus adeno-associato (AAV).
   1. Eroga un'iniezione sottocutanea (s.c.) di lidocaina al 2% (0,2-0,3 ml) al cuoio capelluto come anestetico locale.
      NOTA: L'anestetico locale non viene utilizzato durante l'impianto del catetere endovenoso per evitare alterazioni dei risultati chirurgici.
   2. Collegare una cannula di iniezione in acciaio inossidabile calibro 26 a una siringa Hamilton riempita con 1 μL di soluzione concentrata di AAV: AAV5-hSyn-tdTomato o AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
      NOTA: oChIEF è una variante del canale opsina sensibile alla luce blu (ChR2), che può rispondere a un'ampia gamma di frequenze, e quindi ha utilità per gli esperimenti di depressione a lungo termine a bassa frequenza (LTD) discussi in questo protocollo, ma anche per esperimenti di potenziamento a lungo termine (LTP) ad alta frequenza. Il costrutto oChIEF è stato donato dal Dr. Roger Tsien e lavorato per l'imballaggio e la purificazione dal Duke Viral Vector Core. Sono necessarie almeno 3-4 settimane tra il giorno dell'iniezione e il giorno dell'induzione dell'LTD per consentire un'espressione ottimale del virus nel nucleo genicolato mediale dei terminali assonici del talamo (MGN).
      ATTENZIONE: Generalmente, l'AAV è considerato un organismo di livello di biosicurezza 1 (BSL-1), con un basso rischio di autoinfezione a meno che non venga utilizzato un virus helper nella sua produzione. Il suo utilizzo richiede l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) e devono essere sempre utilizzati adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) in conformità con le linee guida istituzionali per limitare l'esposizione non necessaria.
   3. Usando un bisturi, praticare un'incisione di 0,5 mm dalla parte anteriore a quella posteriore del cranio e rimuovere il tessuto sovrastante per esporre la superficie del cranio.
   4. Livellare la testa del ratto sull'asse anteriore/posteriore e azzerare le coordinate stereotassiche rispetto al bregma.
   5. Pratica tre piccoli fori attraverso il teschio usando uno strumento Dremel dotato di una piccola punta da trapano. Utilizzare un cacciavite per montare saldamente le viti in acciaio inossidabile (M2x4 965-A2) in posizione.
      NOTA: Le viti sono necessarie per legare correttamente il cemento dentale e creare cappucci robusti e di lunga durata. La posizione delle viti deve essere distribuita lungo l'asse antero-posteriore del cranio e lontano dal sito di iniezione dell'AAV.
   6. Praticare fori bilaterali per l'iniezione di AAV in base alle coordinate dell'Atlante del cervello di ratto (Watson e Paxinos) per la porzione mediale del nucleo genicolato mediale (MGN); in mm da bregma, anteroposteriore (AP): -5,4; mediolaterale (ML): ±3,0; dorso-ventrale (DV): -6,6. Abbassare lentamente le cannule di iniezione (4 mm/min) fino a posizionarle nell'MGN. Iniettare la soluzione concentrata di AAV a una velocità di 0,1 μl/min.
   7. Lasciare la cannula di iniezione in posizione per 5 minuti dopo il completamento delle infusioni per consentire la diffusione lontano dalla cannula, quindi ritirare lentamente la cannula dal cervello.
4. Subito dopo le iniezioni del virus, continuare a impiantare fibre ottiche mirate ai terminali MGN-LA.
   1. Usa uno strumento Dremel per praticare fori bilaterali per impianti di fibre ottiche mirati all'amigdala laterale (in mm da bregma, AP: -3.0; ML ±5.1).
   2. Utilizzare una pinza per afferrare la ghiera dell'impianto in fibra ottica e fissarla agli adattatori stereotassici in modo che siano tenuti saldamente in posizione.
   3. Abbassare lentamente le fibre a una velocità di 2 mm/min, fino a quando la punta della fibra si trova nella porzione dorsale del LA (dorsoventrale [DV]: -7,9 mm).
   4. Fissare prima le boccole al cranio utilizzando un sottile strato di adesivo istantaneo Loctite, seguito da cemento dentale e ghiere di copertura con manicotti per ghiere di 1,25 mm di diametro e coperture antipolvere.
      NOTA: La scelta dell'adesivo per fissare le ghiere al cranio deve essere approvata dal comitato locale o istituzionale per la cura e l'uso degli animali. La loctite viene utilizzata per questo studio per fissare in modo affidabile le ghiere al cranio dopo tentativi ed errori con più adesivi; Tuttavia, possono essere prese in considerazione le alternative disponibili.
5. Dopo le procedure chirurgiche, ospita i ratti individualmente e fornisce libero accesso a cibo e acqua. Fornire cure postoperatorie coerenti con le linee guida istituzionali. Lavare quotidianamente i cateteri con soluzione fisiologica contenente gentamicina (5 mg/mL) ed eparina (30 USP/mL) per mantenere la pervietà. Almeno 5 giorni dopo l'intervento chirurgico e 24 ore prima dell'inizio degli esperimenti comportamentali, il cibo limita i ratti a ~90% del loro peso libero.

2. Autosomministrazione di cocaina per roditori ed estinzione strumentale con leva

NOTA: Tutte le procedure comportamentali sono condotte in camere di condizionamento operanti standard, dotate di due leve retrattili su una parete, una luce di stimolo sopra ciascuna leva, un generatore di toni, una luce domestica e una pompa per infusione.

1. Sottopongo i ratti a sessioni giornaliere di allenamento di autosomministrazione di 1 ora di cocaina (2 mg/mL) nell'ambito di un programma di rinforzo a rapporto fisso schedule 1 (FR1).
   1. Metti i ratti in una camera operativa ogni giorno e lascia che i ratti prendano a leva. Una pressione sulla "leva attiva" designata (controbilanciata tra le leve sinistra e destra) provoca un'infusione di cocaina (1,0 mg/kg/infusione) e una presentazione di 10 secondi di un segnale di luce e tono composto. Una pressione sulla "leva inattiva" designata non ha effetti programmati.
   2. Continuare gli esperimenti di autosomministrazione per almeno 10 giorni e fino a quando i ratti non ottengono con successo almeno 8 infusioni al giorno per 3 giorni consecutivi. Il mancato raggiungimento dei criteri di acquisizione entro il giorno 20 comporta l'esclusione dallo studio.
2. Dopo che i criteri di acquisizione sono stati soddisfatti con successo, sottoporre i ratti a sessioni di estinzione strumentale di 1 ora per 6-10 d.
   1. Posizionare i ratti nelle camere operanti e consentire ai ratti di premere liberamente la leva. Tuttavia, le risposte sia sulla leva attiva che su quella inattiva non hanno conseguenze programmate.
   2. I ratti continuano l'estinzione strumentale ogni giorno fino a quando non si verificano in media < 25 pressioni della leva in due giorni consecutivi.

3. Induzione optogenetica in vivo di LTD

NOTA: Gli esperimenti di inibizione optogenetica si svolgono 24 ore dopo l'ultimo giorno di estinzione strumentale.

1. Collega i cavi patch a un diodo laser blu da 473 nm tramite un giunto rotante sospeso sopra una gabbia standard per roditori pulita con il coperchio rimosso. Questa configurazione consente ai roditori di muoversi liberamente all'interno della gabbia durante la stimolazione optogenetica.
2. Accendere il diodo laser secondo le istruzioni per l'uso e collegarlo a un generatore di impulsi. Regolare le impostazioni in modo che, una volta acceso, il ratto riceva 900 impulsi di luce da 2 ms a 1 Hz.
   ATTENZIONE: È necessario utilizzare sempre un'adeguata protezione per gli occhi durante il funzionamento del laser.
3. Misurare l'intensità della luce attraverso il cavo patch utilizzando un sensore di luce. Regolare l'intensità del laser in modo che l'emissione di luce attraverso il cavo patch sia ~5-7 mW.
4. Metti i ratti in una gabbia pulita. Rimuovere i coperchi antipolvere e i manicotti delle ghiere, esponendo le ghiere. Collegare i cavi patch bilateralmente agli impianti in fibra ottica. Consentire ai ratti di esplorare l'ambiente per 3 minuti prima dell'induzione LTD.
5. Accendere il generatore di impulsi per avviare la stimolazione optogenetica.
   NOTA: Sebbene improbabile, se i ratti manifestano reazioni avverse alla stimolazione, l'esperimento viene immediatamente terminato e i ratti vengono adeguatamente soppressi in base alle linee guida istituzionali.
6. Dopo l'induzione LTD, tieni i ratti nella gabbia per 3 minuti, quindi rimettili nelle loro gabbie domestiche.
7. Per gli esperimenti di controllo, utilizzare la stessa procedura di stimolazione sui ratti che esprimono il virus di controllo AAV5-tdTomato. Per gli esperimenti fittizi, collegare un cavo patch alla fibra ottica dei ratti che esprimono il virus AAV5-oChIEF, ma durante una sessione di 15 minuti non viene erogata alcuna stimolazione.

4. Testare l'effetto della stimolazione optogenetica sulla ricerca di cocaina indotta da un segnale

1. 24 h dopo le stimolazioni optogenetiche in vivo, rimettere i ratti in camere di condizionamento operanti. I ratti sono sottoposti a una sessione di reintegrazione standard indotta da un segnale di 1 ora per valutare il comportamento di ricerca della cocaina.
   NOTA: Durante il reintegro indotto dal segnale, una risposta sulla leva attiva produce una presentazione di 10 secondi del segnale associato alla cocaina, ma nessuna infusione di cocaina.
2. Somministrare un secondo test di reintegrazione almeno 1 settimana dopo il primo test per determinare se l'induzione optogenetica della LTD si traduce in una soppressione a lungo termine della ricerca di cocaina

Materiali