Cambiamenti di equilibrio nella struttura di monitoraggio RNA da 'perossidativi' e 'ossidativo' Footprinting radicale ossidrile

Summary

Questo protocollo descrive come quantificare il Mg (II)-dipendente formazione della struttura terziaria dell'RNA con due metodi di footprinting radicali idrossili.

Abstract

Molecole di RNA svolgono un ruolo essenziale in biologia. Oltre alla trasmissione di informazioni genetiche, l'RNA può piegare in unico strutture terziarie che compie un ruolo biologico specifico come regolatore, legante o catalizzatore. Informazioni sulla formazione terziaria contatto è essenziale per capire la funzione di molecole di RNA. I radicali idrossile (OH •) sono le sonde della struttura degli acidi nucleici a causa della loro elevata reattività e piccole dimensioni. ¹ Quando utilizzato come sonda footprinting, i radicali idrossili mappare la superficie solvente accessibile della dorsale fosfodiestereo di DNA ¹ e ² con RNA sottile come singolo nucleotide risoluzione. Idrossile footprinting radicale può essere utilizzato per identificare i nucleotidi all'interno di una superficie di contatto intermolecolari, ad esempio nel DNA-proteina ¹ e RNA-proteina complessi. Equilibrio ³ e ⁴ transizioni cinetica può essere determinato da condurre footprinting radicale ossidrile in funzione di una soluzione moltoil variabile o il tempo, rispettivamente. Una caratteristica fondamentale di footprinting è che l'esposizione limitata alla sonda (per esempio, 'single-hit cinetica') i risultati nel campionamento uniforme di ogni nucleotide del polimero ^5.

In questo articolo il video, si usa il P4-P6 dominio del ribozima Tetrahymena per illustrare la preparazione dei campioni di RNA e la determinazione di un (II)-mediata isoterme Mg pieghevole. Descriviamo l'uso del noto protocollo di idrossile footprinting radicale che richiede H ₂ O ₂ (chiamiamo questo il protocollo 'perossidativi') e un valore, ma poco noto, alternativa che utilizza naturalmente disciolto O ₂ (lo chiamiamo la ' ossidativo 'protocollo). Una panoramica della riduzione dei dati, la trasformazione e procedure di analisi è presentato.

Protocol

1. Preparazione dei reagenti Footprinting

1. Preparare un tampone di reazione 10x contenente 100 cacodilato sodio mM, 1 mM EDTA, e 1 M KCl. Regolare il pH a 7,4. Filtrare il tampone usando un dispositivo di acetato 0,2 mM filtro (Nalgene). Nota: non RNA pipettare direttamente nel buffer 10x.
2. Preparare la miscela di reazione di titolazione per ogni reazione, come indicato nella tabella 1. Il volume del mix di titolazione (1x buffer e Mg (II) alla concentrazione desiderata) dovrebbe essere di 90 microlitri, prima di aggiungere 10μl di RNA nel buffer 1x.
3. Preparare una digestione RNasi T1 tampone contenente urea 6.63M, citrato di sodio 20 mM, ....

Discussion

Footprinting radicale ossidrile è uno strumento prezioso per valutare l'area solvente superficie accessibile di acidi nucleici. Formazione qualitativa e quantitativa della struttura terziaria ¹⁴ può essere seguita in funzione di parametri quali il tipo e la concentrazione di ioni, pH, temperatura, proteine ​​di legame o pieghevoli co-fattori. La combinazione vincente di un protocollo di dritto in avanti ed economico e l'accessibilità conseguente solvente e le informazioni su un pieghevole a singolo nucleotide.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome		Azienda Gatto #
Sodio Cacodylate (Attenzione! Tossico)	Sigma-Aldrich	C4945-25g
EDTA (0,5 M)	Ambion	AM9260G
acqua trattata DEPC	Ambion	AM9915G
Acetato di sodio (3 M)	Ambion	AM9740
MgCl2 (1 M)	Ambion	AM9530G
	Urea Ambion	AM9902
Sodio Citrato	Sigma-Aldrich	W302600
tRNA	Sigma-Aldrich	R-7876
Sodio-L-ascorbato	Sigma-Aldrich	A7631-25g
Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O	Sigma-Aldrich	F1543-500g
RNasi T1	Fermentas	EN0541
Perossido di idrogeno (30%)	Sigma-Aldrich	349887