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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Modello murino di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO)
- Utilizzare topi maschi C57BL/6 di 6 settimane di età e del peso di 22-25 g. Fornire a tutti gli animali libero accesso a cibo e acqua standard e ospitarli in un ambiente con temperatura controllata (22 ±1°C) e un ciclo luce/buio di 12 ore.
- Dividi i topi in gruppi di sei topi ciascuno, che dovrebbero consistere in gruppi di trattamento normale, di controllo e di Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (GRex) operati da sham.
- Eseguire la chirurgia MCAO sui gruppi di controllo e di trattamento GRex utilizzando uno stereomicroscopio.
- Indurre l'anestesia per inalazione nei topi utilizzando isoflurano al 2% in protossido di azoto (N₂O) al 70% e ossigeno (O₂) al 30%. L'anestesia è considerata sufficiente quando il topo non risponde a uno stimolo meccanico applicato alla coda. Mantenere la temperatura corporea dei topi a 36,5 ± 0,5 °C utilizzando una coperta per il mantenimento della temperatura corporea collegata a un termometro.
- Rimuovere tutti i peli sul petto e sul collo dei topi mediante rasatura, seguita dall'uso di una crema depilatoria. Disinfettare il sito chirurgico della pelle con scrub betadine alternato ad alcool due volte, quindi praticare un'incisione di circa 2 cm di lunghezza con una lama chirurgica al centro del collo. Isolare attentamente l'arteria carotide comune sinistra (LCCA), l'arteria carotide esterna e il ramo dell'arteria carotide interna dai tessuti connettivi circostanti.
- Legare l'arteria carotide esterna e l'arteria carotide comune con una sutura chirurgica (sutura di seta 4-0, nodo a mezzo nodo) per bloccare temporaneamente il flusso sanguigno nell'arteria carotide interna durante l'operazione.
- Inserire una sutura di nylon rivestita di silicone (monofilamento 8-0, lunga 11 mm) attraverso l'arteria carotide interna fino all'origine dell'MCA sinistro. Regolare lo spessore della parte rivestita di silicone del filamento a un intervallo compreso tra 0,10 e 0,12 mm.
- Misurare la diminuzione del flusso sanguigno cerebrale relativo (rCBF) nell'MCA utilizzando un flussimetro laser Doppler. La MCAO sarà confermata quando l'rCBF sarà mantenuto a < 20% dei valori della condizione di riposo durante l'intero periodo ischemico.
- Fissare il filamento inserito al vaso sanguigno per 2 ore mentre l'arteria cerebrale è occlusa, quindi ritirare con cura il filamento per ripristinare il flusso sanguigno per 22 ore di riperfusione. Sutura la pelle cucendo in cinque punti (sutura di seta 3-0, due nodi a mezzo nodo) e lascia che ogni topo si svegli dall'anestesia.