Induzione di lesioni del nervo peroneale in un topo per studiare la rigenerazione della giunzione neuromuscolare

Abstract

Fonte: Dalkin, W., et al. Il metodo della lesione del nervo peroneale: un test affidabile per identificare e testare i fattori che riparano le giunzioni neuromuscolari. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra una procedura chirurgica per indurre una lesione del nervo peroneale in un topo per studiare la rigenerazione della giunzione neuromuscolare (NMJ). La procedura prevede l'esposizione del nervo peroneale, l'applicazione di una pressione controllata per indurre la lesione e la garanzia che l'epineurio rimanga intatto per supportare la rigenerazione assonale. Nel tempo, i macrofagi rimuovono i detriti assonali, facilitando la riparazione dei nervi e il ristabilimento delle NMJ.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione degli animali per l'intervento chirurgico

1. Anestetizzare i topi con una miscela di ketamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) tramite iniezione inguinale sottocutanea con una siringa da insulina sterile da 1 ml. La soluzione di vettore contiene una miscela di soluzione fisiologica allo 0,9%, 17,4 mg/ml di ketamina e 2,6 mg/ml di xilazina. Rimettere gli animali in gabbia in attesa che i farmaci facciano effetto.
   NOTA: Se la dose di carico non fornisce un'anestesia sufficiente per la durata della procedura, può essere iniettato un ulteriore 25% della dose di carico.
2. Monitorare gli animali dopo l'iniezione per verificare la stabilità della frequenza respiratoria e l'appropriata depressione dei livelli di eccitazione. Controllare il livello di eccitazione con un pizzico del piede posteriore, che non dovrebbe suscitare alcuna risposta quando sufficientemente anestetizzato.
   NOTA: Questo di solito richiede 3-5 minuti per un topo giovane adulto con una media di 25-30 g. Se l'animale è ancora reattivo dopo 10 minuti dall'iniezione, può essere iniettato un ulteriore 25% della dose di carico dell'anestetico.
3. Applicare vasellato e olio minerale leggero unguento oftalmico sugli occhi dell'animale per prevenire la secchezza. Togliete gli animali dalla gabbia e posizionateli su una superficie piana e pulita. Radere l'arto posteriore desiderato dal piede al bacino utilizzando un tagliapeli elettrico, esponendo solo l'aspetto laterale dell'arto.
4. Applicare un depilatore chimico sul sito rasato per 1 minuto. Rimuovere manualmente i peli utilizzando salviette da laboratorio. Pulire l'area depilata con una salvietta da laboratorio imbevuta di etanolo.

2. Procedura chirurgica

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici in autoclave o con un altro metodo appropriato. Pulire il sito chirurgico e la tavola chirurgica con etanolo all'80%/H₂O. Disinfettare il sito chirurgico con providone. Posizionare il mouse sulla tavola chirurgica e allinearlo con i sistemi di ritenuta degli arti. Mantenere l'arto posteriore bersaglio in una posizione anatomicamente naturale con l'articolazione del ginocchio leggermente estesa senza rotazione interna o esterna.
2. Posizionare l'animale e la tavola sotto il microscopio operatorio. Orientare verso il sito di incisione corretto tramite la palpazione dei punti di riferimento superficiali, in particolare l'articolazione ossea del ginocchio e la cresta tra i muscoli tibiale anteriore e gastrocnemio.
3. Praticare un'incisione di circa 3 cm attraverso la pelle utilizzando un bisturi o forbici a molla mentre si utilizza una pinza generale per la presa. Praticare l'incisione perpendicolarmente al decorso sottostante del nervo peroneale comune.
4. Continuare l'incisione attraverso la fascia superficiale, esponendo i muscoli bicipite femorale e vasto laterale. Separare questi muscoli tagliando la fascia profonda di collegamento. Un taglio di 1-2 cm dovrebbe essere sufficiente.
5. Ritrarre il muscolo bicipite femorale caudalmente utilizzando divaricatori meccanici, rivelando il nervo peroneale comune.
6. Tracciare il nervo prossimalmente fino a quando non si trova la sua intersezione con il tendine della testa laterale del muscolo gastrocnemio.
   Nota: l'esposizione può richiedere un'ulteriore manipolazione della pelle e del muscolo retratti. Questa intersezione viene utilizzata come punto di riferimento stabile per le lesioni nervose.
7. Afferrare il nervo con una pinza fine, allineando le punte in modo parallelo al bordo laterale del tendine del gastrocnemio. Schiacciare il nervo peroneale comune applicando una pressione costante e forte per 5 secondi.
8. Corroborare l'intero schiacciamento del nervo mediante ispezione visiva attraverso l'endoscopio chirurgico. Apparirà traslucido nel sito della lesione. Se si utilizzano topi che esprimono proteine di fluorescenza negli assoni periferici, la fluorescenza scomparirà dal sito della lesione.
9. Rimuovere i divaricatori e riallineare i muscoli nelle loro posizioni anatomiche. Chiudere il sito di incisione con punti di sutura di seta 6-0. Sono sufficienti 1-3 semplici suture interrotte. Posiziona il mouse di recupero su un termoforo in una gabbia pulita.
10. Monitorare tutti gli animali per 2 ore dopo l'operazione per verificare la respirazione e le eventuali reazioni avverse all'anestesia. Somministrare una dose iniziale di buprenorfina 0,05-0,10 mg/kg tramite iniezione inguinale sottocutanea immediatamente dopo il recupero dall'intervento chirurgico. Somministrare 3 dosi aggiuntive ogni 12 ore nelle successive 48 ore. Dopo il completo recupero, riporta i topi alla struttura di cura degli animali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ketamine	VetOne	501072
Xylazine	Lloyd Inc.	3437
Buprenorfina	Zoopharm	1Z-73000-150910
Nair	Nair
Kim-salviette Kimtech		34155
Rasoio elettrico	Braintree Scientific	CLP-64800
80% EtOH/H₂O
10% Proviodine
1 ml Siringa da
Forbici a molla	Vannas	91500-09
No. 15 bisturi	Braintree Scientific	SSS 15
#5 Pinze	Dumont	11252-00
6-0 sutura di seta su ago da taglio inverso	Suture Express	752B
Termoforo per roditori	Braintree Scientific	AP-R-18.5
sonde molecolari	alfa-BTX coniugate	B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Microscopio stereo zoom Olympus	562037192 Microscopio
700	Olympus
Pompa per perfusione peristaltica a portata regolabile	Fisher Scientific	13-876-3

insulinaAlexa 555 confocale Zeiss