Esecuzione personalizzati Esperimenti di Microarray MicroRNA

Summary

Una semplice procedura di eseguire esperimenti microarray su ordinazione microRNA è descritto. I passaggi includono isolare RNA, l'etichettatura RNA e DNA di riferimento, ibridando i campioni di microarray, la scansione del microarray, quantificare e analizzare segnali di ibridazione.

Abstract

microRNA (miRNA) sono una grande famiglia di circa 22 nucleotidi (nt) lungo molecole di RNA che sono ampiamente espresse in eucarioti ^1. Genomi complessi codificare almeno centinaia di miRNA, che in primo luogo inibire l'espressione di un vasto numero di geni bersaglio post-trascrizionalmente ^{2, 3.} miRNA controllare una vasta gamma di processi biologici ^1. Inoltre, l'espressione di miRNA alterata è stata associata a malattie umane come i tumori, e miRNA possono servire come biomarcatori per le malattie e la prognosi ^{4, 5.} E 'importante, quindi, per capire l'espressione e le funzioni dei miRNA in diverse condizioni.

Tre approcci principali sono stati impiegati per profilo di espressione di miRNA: real-time PCR, microarray e sequenziamento profondo. La tecnica dei microarray miRNA ha il vantaggio di essere high-throughput, generalmente meno costose, e la maggior parte delle fasi sperimentali e di analisi può essere carrIED in un laboratorio di biologia molecolare alla maggior parte delle università, scuole di medicina e gli ospedali associati. Qui, descriviamo un metodo per l'esecuzione di esperimenti microarray su ordinazione miRNA. Un insieme sonda miRNA verrà stampato su vetrini microarray per produrre miRNA. RNA è isolato utilizzando un metodo o reagente che conserva le piccole specie di RNA, e poi etichettato con un colorante fluorescente. Come controllo, oligonucleotidi DNA di riferimento corrispondente a un sottoinsieme dei miRNA sono etichettati con un colorante diverso fluorescenza. Il DNA di riferimento servirà per dimostrare la qualità della diapositiva e l'ibridazione e sarà anche utilizzata per la normalizzazione dei dati. L'RNA e DNA si mescolano e ibridato a una diapositiva microarray contenenti sonde per la maggior parte dei miRNA nel database. Dopo il lavaggio, la diapositiva viene sottoposto a scansione per ottenere immagini e intensità dei punti individuali quantificati. Questi segnali prime saranno ulteriormente elaborati e analizzati i dati di espressione dei miRNA corrispondente. MicroArray diapositive possono essere rimossi e rigenerata per ridurre i costi di microarray e di migliorare la coerenza degli esperimenti microarray. Gli stessi principi e le procedure sono applicabili ad altri tipi di esperimenti microarray su ordinazione.

Protocol

1. Stampa di microarray miRNA personalizzate

1. Stampare il microarray diapositive utilizzando i servizi di base impianto di microarray presso un'università o una società. La qualità dei microarray fabbricazione è uno dei fattori più critici per il successo di un esperimento di microarray. Provate alcuni servizi, se possibile. Idealmente, si potrebbe stampare 50-100 diapositive alla volta, e tutte le diapositive sarà identico, con ben separate, i punti individuali.
2. Per il supporto microarray, usiamo il II APERTURE vetrini rivestiti.
3. Per le sonde miRNA, si usa il nCode multispecie miRNA Microarray Probe Set V2.
4. Sciogliere tutti gl....

Discussion

Nonostante i recenti progressi nelle tecnologie di sequenziamento profondo, microarray rimane una scelta praticabile per high-throughput analisi del DNA e RNA. Rispetto al sequenziamento profondo, gli esperimenti microarray sono più economici, e un laboratorio di biologia molecolare tipico in grado di eseguire la maggior parte degli esperimenti e analisi dei dati in-house, che consente flessibilità e consente di risparmiare tempo. In futuro, microarray probabilmente adatto a interrogare intensamente insiemi di geni, per.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Articoli	Venditore	Numero di catalogo	Commenti
NCode multi-specie miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Progettato sulla base del miRBase versione 9.0 (ottobre 2006). Esso contiene ~ 1140 non modificato, 34-44 oligonucleotidi nt lungo come sonde per verme, volare, zebrafish, topo, ratto, e miRNA umani, e una serie di sonde di controllo interno, come snoRNAs. Le sonde miRNA sono doppietti delle sequenze complementari a miRNA maturo, quindi le dimensioni di ~ 44 nt. Per l'analisi si può concentrare su miRNA da un genoma particolare (s) di interesse.
Trizol	Invitrogen	15596018	Abbiamo usato anche arricchito, piccola frazione di RNA per l'etichettatura, anche se campioni di RNA totale sono più veloci e più facili da preparare e di quantificare e adatto per applicazioni a valle quali l'analisi di mRNA.
T4 RNA ligasi 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Kit Etichettatura	Invitrogen	U21660	Questo kit o prodotti simili possono essere usati per l'etichetta sperimentale campioni di RNA o RNA di controllo (invece di DNA di controllo) pure.
5'-PCU-DY547-3 '	Dharmacon	Una soluzione su misura	Piccola frazione di RNA possono essere etichettati in modo simile da legatura.
CentriSep colonne	Princeton separazioni	CS-901
GAPSII scivolo rivestito	Corning	40004	Altri tipi di diapositive può essere utilizzato anche.
Microarray ibridazione camere	Corning	2551 o 40080	Altri tipi di camere di ibridazione e coprioggetto dovrebbe funzionare. Utilizzo di macchinari ibridazione disponibili in commercio possono ridurre il tempo di ibridazione in modo significativo, ad esempio, per circa 2 ore.
Lifterslips	ThErmo / Erie scientifico	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent