L'uso del Modello EpiAirway per Caratterizzare a lungo termine interazioni ospite-patogeno

Summary

Questo metodo permette la caratterizzazione di batteri estesa co-coltura con EpiAirways, primario dei tessuti epiteliali respiratorie umane cresciute all'interfaccia aria-liquido, un biologicamente rilevanti In vitro Modello. L'approccio può essere utilizzato con qualsiasi microbo che è suscettibile di lungo termine co-coltura.

Abstract

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) sono umani adattati batteri Gram-negativi che possono causare infezioni ricorrenti e croniche della mucosa respiratoria ^{1, 2.} Per studiare i meccanismi con cui questi organismi sopravvivono e nei tessuti delle vie respiratorie, un modello in cui il successo a lungo termine co-coltura di batteri e cellule umane possono essere eseguite è necessario. Noi uso primario tessuti umani epiteliali delle vie respiratorie sollevato in aria-liquido, il modello EpiAirway (MatTek, Ashland, MA). Questi non sono immortalati, ben differenziato, 3-dimensionale dei tessuti che contengono le giunzioni strette, le cellule ciliate e nonciliated, cellule caliciformi che producono mucina, e conservare la capacità di produrre citochine in risposta alle infezioni.

Questo biologicamente rilevanti modello in vitro delle vie aeree superiori umana può essere utilizzato in diversi modi; l'obiettivo generale di questo metodo è quello di eseguire a lungo termine co-coltura di tessuti EpiAirway con NTHi e quantificare associato alle cellule dei batteri e interiorizzato nel tempo . Inoltre, la produzione mucina e il profilo delle citochine degli infetti co-culture può essere determinato. Questo approccio migliora metodi esistenti in molti protocolli attuali che utilizzano sommersi colture monostrato o Transwell di cellule umane, che non sono in grado di supportare le infezioni batteriche per lunghi periodi ^3. Per esempio, se un organismo in grado di replicare sui media sovrastante, questo può portare a livelli inaccettabili di citotossicità e la perdita di cellule ospiti, arrestando l'esperimento. Il modello EpiAirway permette la caratterizzazione di lungo termine, interazioni ospite-patogeno. Inoltre, dato che l'origine per il EpiAirway è normale umano tracheo-bronchiali cellule piuttosto che una linea immortalato, ognuno è un'eccellente rappresentazione del reale tessuto umano del tratto respiratorio superiore, sia nella struttura e nella funzione ^4.

Per questo metodo, i tessuti EpiAirway sono svezzati fuori di composti anti-microbico e anti-fungini per 2 giorni prima della consegna, e tutte le procedure vengono eseguite sotto antibiotico senza condizioni. Ciò richiede considerazioni particolari, in quanto sia i batteri e primario dei tessuti umani sono usati nello stesso armadio biosicurezza, e sono co-coltura per lunghi periodi.

Protocol

1. Preparazione del cabinet biosicurezza per i tessuti EpiAirway

1. Indossando un camice da laboratorio dedicato, con i capelli raccolti sulla nuca e guanti, avviare il flusso laminare. Dopo 5 minuti, spostare qualsiasi strumento nell'armadio (pipette, consigli, provette da centrifuga, ecc) da un lato, spruzzare l'interno dell'armadio biosicurezza e fascia con il 70% di etanolo e pulire con tovaglioli di carta puliti. Spruzzare l'interno pulito di nuovo con il 70% di etanolo e lasciare asciugare. Spostare gli strumenti per il lato pulito e ripetere la procedura di etanolo.
2. Usa aerosol puntali barriera e pipettatori dedicato nel gabinetto. Per utiliz....

Discussion

Questo metodo permette l'indagine di lungo termine, interazioni ospite-patogeno in un ambiente biologicamente rilevanti di primaria tessuti umani respiratorio all'interfaccia aria-liquido interfaccia. Qui abbiamo usato NTHi come l'organismo infettante, ma l'interazione di qualsiasi batterio che non introduce citotossicità inaccettabile nel corso del tempo può essere quantificata con questo metodo. Il modello EpiAirway può essere utilizzato anche per lo studio dei virus, le droghe, o sostanze chimiche che.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Catalogo #	Commenti
Saponina	Calbiochem	558255-25GM	1% in D-PBS senza calcio e magnesio, filtro sterilizzare
1 X Dulbecco PBS con calcio e magnesio	Lonza	17-513Q
1 X Dulbecco PBS senza calcio e magnesio	Lonza	17-515Q
EpiAirway antibiotico senza tessuti	MatTek	AIR-100-ABF
EpiAirway antibiotico senza manutenzione mezzi di comunicazione	MatTek	AIR-100-MM-ABF	Fornito con il kit
Tampone fosfato 10X soluzione salina	EMD	6506	Diluire a 1X prima dell'uso
Gelatina	JT Baker	2124-01	Aggiungere a una concentrazione finale del 0,1% nel 1 X PBS e autoclave
Difco GC Base Media (agar cioccolato)	VWR	90002-016	Autoclave 36 g in 500 ml di DDH 2 O e raffreddare a 60 ° C
BBL emoglobina (agar cioccolato)	VWR	90000-662	Autoclave 10 g in 500 ml di DDH 2 O, raffreddare a 60 ° C e miscelare con la base medio GC sopra
BD BBL IsoVitaleX arricchimento (agar cioccolato)	VWR	90000-414	Raffreddare la miscela di base medio GC e emoglobina a 55 ° C e aggiungere 10 ml di IsoVitaleX reidratato, versare piastre di agar cioccolato
Dissettore, punta fine, curva	VWR	82027-406
Autosigillante sterilizzazione buste	VWR	89140-802
Gentamicina solfato, 10 mg / ml	Lonza	17-519Z	Aggiungere 10 microlitri / ml a MM EpiAirway per uccidere gentamicina