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DNA mitocondriale (mtDNA) difetti sono una causa importante di malattia e può essere alla base dell'invecchiamento e all'invecchiamento 1,2 alterazioni. La teoria mitocondriale dell'invecchiamento suggerisce un ruolo per le mutazioni del mtDNA, che possono alterare l'omeostasi bioenergetica e la funzione cellulare, nel processo di invecchiamento 3. Una ricchezza di prove è stato redatto a sostegno di questa teoria 1,4, un esempio è il mtDNA mutator mouse 5, tuttavia, il ruolo preciso dei danni del DNA mitocondriale nell'invecchiamento non è del tutto compreso 6,7.
Osservando l'attività degli enzimi respiratori è un approccio semplice per lo studio disfunzione mitocondriale. Complesso IV o citocromo c ossidasi (COX), è essenziale per la funzione mitocondriale. La subunità catalitica del COX sono codificati da mtDNA e sono essenziali per l'assemblaggio del complesso (Figura 1). Così, la sintesi corretta e la funzione sono in gran parte sulla base di mtDNA integrità 2.Anche se altri complessi respiratori potrebbero essere indagati, Complessi IV e II sono i più suscettibili di esame istochimico 8,9. Complesso II, o succinato deidrogenasi (SDH), è interamente codificato dal DNA nucleare (Figura 1), e la sua attività non è in genere affetti da compromissione del mtDNA, anche se un aumento potrebbe indicare la biogenesi mitocondriale 10-12. Il mtDNA alterato osservati in malattie mitocondriali, invecchiamento e malattie legate all'età conduce spesso alla presenza di cellule con scarsa o assente attività COX 2,12-14. Anche se le attività COX e SDH possono essere analizzati individualmente, il sequenziale a doppia etichettatura 15,16 metodo ha dimostrato di essere vantaggioso per localizzare le cellule con disfunzione mitocondriale 12,17-21.
Molte delle costituzioni ottimale del test sono stati determinati, come la concentrazione del substrato, accettori di elettroni / donatori, intermedio trasportatori di elettroni, l'influenza del pH, e t reazioneime 9,22,23. 3,3 '-diaminobenzidina (DAB) è un donatore di elettroni efficace ed affidabile 22. Nelle cellule con il funzionamento della COX, il marrone indamine polimero prodotto sarà localizzare in creste mitocondriali e saturare le cellule 22. Queste cellule disfunzionali con COX quindi non sarà saturata dal prodotto DAB, consentendo la visualizzazione di attività SDH con la riduzione del tetrazolio (NBT), accettore di elettroni, di un blu prodotto finale formazan 9,24. Citocromo c e substrati succinato di sodio vengono aggiunte per normalizzare i livelli endogeni tra controllo e malati / mutante tessuti 9. Catalasi viene aggiunto come precauzione per evitare possibili reazioni contaminazione da attività di perossidasi 9,22. Methosulfate Phenazine (PMS), un vettore intermedio di elettroni, viene utilizzato in combinazione con sodio azide, un inibitore della catena respiratoria, per aumentare la formazione di prodotti di reazione finale di 9,25. Nonostante questo informarezione, alcuni dettagli fondamentali che influenzano il risultato di questo test conveniente semplice, in aggiunta ai controlli specificità e avanzamenti nella tecnica, non sono ancora stati presentati.