Articolo metodologico

Un metodo per l'etichettatura vasi embrionali nei topi

DOI:

10.3791/3267

⸱

7 ottobre 2011

 ,  , 
1Department of Cellular Biology, University of Georgia, 2Centre for Immunology and Infection, Department of Biology and HYMS, University of York, 3Department of Genetics, University of Georgia

In questo articolo

Sommario

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Questo articolo descrive un metodo per l'etichettatura di pelle embrionale e vasi sanguigni timo.

Abstract

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La creazione di una rete funzionale vaso sanguigno è una parte essenziale di organogenesi, ed è necessario per il funzionamento ottimale degli organi. Per esempio, nella formazione timo corretta vascolarizzazione ed il modello è indispensabile per l'ingresso timocita nell'organo e maturo delle cellule T uscita alla periferia. La disposizione spaziale dei vasi sanguigni nel timo dipende segnali provenienti dal microambiente locale, cioè le cellule epiteliali timiche (TEC). Diversi rapporti recenti suggeriscono che la perturbazione di questi risultati segnali in timo vaso sanguigno 1,2 difetti. Studi precedenti hanno descritto le tecniche utilizzate per etichettare il neonatale e adulto vascolarizzazione del timo 1,2. Si dimostra qui una tecnica per l'etichettatura dei vasi sanguigni nel timo embrionale. Questo metodo combina l'uso di FITC-destrano o Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina I (GSL 1 - isolectin B 4) iniezioni vena facciale e CD31 colorazione anticorpi per identificare timo strutture vascolari e PDGFR-β per etichettare timo mesenchima perivascolare 3-5. La possibilità di utilizzare criosezioni o sezioni vibratome inoltre è fornita. Questo protocollo può essere utilizzato per identificare timo difetti vascolari, che è fondamentale per definire i ruoli di TEC-molecole derivate timo nella formazione dei vasi sanguigni. Come metodo di etichette intero sistema vascolare, può anche essere usato per analizzare le reti vascolari in molti organi e tessuti in tutto l'embrione tra pelle e cuore 6-10.

Protocollo

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1. Fluorescina etichettata destrano e GSL I-isolectin B 4 iniezioni vena facciale per etichettare vasi embrionali

  1. Preparare FITC-destrano (50ug/mL) in soluzione tampone fosfato (PBS) o GSL 1 - isolectin B 4 (20ug/200uL) in PBS in un tubo Eppendorf 1,5 ml e caldo a 37 ° C. Aggiungi 100uL di magazzino 1,25 mm Fast Green / PBS al FITC-destrano soluzione (volume totale 1 ml) e 180uL di azioni da 1,25 mm Fast Green / PBS per la GSL 1 - isolectin B 4 (200uL volume totale), in modo che la soluzione è visibilmente blu.
  2. Sezionare E14.5 E18.5-embrioni e sacco vitellino insieme, lasciando il gambo allantoide (arteria e vena ....

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Discussione

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Whole-mount e PECAM-1 (CD31) colorazione sulle sezioni sono i metodi convenzionali per l'etichettatura del sistema vascolare nei topi embrionale. Questi metodi richiedono l'uso di immunofluorescenza diretta e / o indiretta, e detergenti per permeabilize tessuto del mouse. Questo risulta essere un processo piuttosto tempestivo. Qui, abbiamo impiegato FITC-destrano o isolectin B 4 iniezioni vena facciale per etichettare direttamente la vascolarizzazione embrionali, eliminando così la necessità di fasi d.......

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dai numeri concedere R01AI055001 e R01AI082127 dal NIAID di NRM e Premio tesi SREB Fellowship di JLB.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reagente Azienda Numero di catalogo
FITC-destrano Sigma FD150S-1G
Fluorescina etichettata GSL 1 - isolectin B 4 Laboratori Vector FL-1201
Fast Green MP Biomedicals 195178
PFA Fluka 76240
Siero bovino fetale Atlanta Biologicals S11550
Temperatura ottimale composto da taglio (OCT VWR 25608-930
Acetone JT Baker 9006-33
Donkey Siero Jackson 017-000-121
topo anti-topo CD31, BD Pharmingen 558736
capra anti-topo PDGFR-β R & D Systems AF1042
asino anti-ratto CD31 Alexa 647 (Invitrogen) Biolegend 102516
asino anti-capra Alexa 594 (Invitrogen) Invitrogen A11058
Triton X -100 Sigma-Aldrich X-100
Bassa temperatura di fusione agarosio / PBS Sigma-Aldrich A9414-25G
Metanolo Fisher Scientific A413-4
L'alcol benzilico Acros scientifico 148390010
Benzyl Benzoate Acros scientifico 105860010
Depressione diapositive Fisher Scientific S175201
Fluorogel Electron Microscopy Sciences 17985-10
Copertura di vetro (22x22) -1,5 Thermo Scientific 152222
Zeiss LSM 510 Meta microscopio confocale Zeiss
Micro dissettore Roboz RS-5135
Parafilm No. OM992 Fisher Scientific 13-374-16
12 e 24 micropiastre bene Evergreen scientifico 222-8044-01F
SuperFrost / Plus Microscopio Slides Fisher Scientific 12-550-15
4 ml fiale chiaro Scientifico Nazionale B7800-2

Riferimenti

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  1. Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
  2. Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ....

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Vascolarizzazione embrionale di topoiniezione nella vena faccialemarcatura con FITC destranoisolectina B4 GSL 1colorazione con anticorpo CD31PDGFR beta perivascolareprotocollo di criosezionamentosezionamento con vibratomoimaging mediante microscopia confocaleanalisi vascolare del timo

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