$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Fluorescina etichettata destrano e GSL I-isolectin B 4 iniezioni vena facciale per etichettare vasi embrionali
- Preparare FITC-destrano (50ug/mL) in soluzione tampone fosfato (PBS) o GSL 1 - isolectin B 4 (20ug/200uL) in PBS in un tubo Eppendorf 1,5 ml e caldo a 37 ° C. Aggiungi 100uL di magazzino 1,25 mm Fast Green / PBS al FITC-destrano soluzione (volume totale 1 ml) e 180uL di azioni da 1,25 mm Fast Green / PBS per la GSL 1 - isolectin B 4 (200uL volume totale), in modo che la soluzione è visibilmente blu.
- Sezionare E14.5 E18.5-embrioni e sacco vitellino insieme, lasciando il gambo allantoide (arteria e vena ombelicale) intatti.
- Trasferimento degli embrioni per un nuovo piatto Petrie (60 X 15 mm) e immergerli in PBS a temperatura ambiente.
- Posizionare l'embrione per fornire una visione sagittale della testa / viso. Usa micro dissettore ad afferrare delicatamente l'embrione alla testa.
- Utilizzando un ago 30G, iniettare 50uL FITC-destrano (50ug/mL) o GSL 1 - isolectin B 4 (in 20ug 200uL PBS) nella vena del viso che punta l'ago verso la parte posteriore della testa.
- Quando il colorante è visibile nella vena ombelicale, rimuovere l'ago e separare l'embrione dal gambo allantoide (arteria e vena ombelicale).
- A seguito di iniezioni, permette all'embrione di rimanere in PBS a temperatura ambiente per 2-3 minuti in modo che il colorante circola in tutto l'embrione.
2. Tutto-mount analisi di vascolarizzazione della pelle
- Dopo aver lasciato la tintura di circolare in tutta l'embrione, rimuovere campioni di pelle da regioni degli arti, alla schiena e allo stomaco, ecc 8,9.
- Lavare campione di pelle in PBS freddo, e fissare nel 4% PFA / PBS per 2 ore 8,9. Lavare 3 volte per 10 minuti ogni 4 ml in flaconcino trasparente con 2 ml PBS freddo.
- Pelle del campione posto su un vetrino da microscopio e aggiungere 100 ml di montaggio di mezzi di ogni diapositiva e un vetro di copertura.
- Lasciare i vetrini si asciughino in una zona di conservazione al buio.
- Procedere al passaggio sezione 'acquisizione di immagini' 2.
3. Multi-color etichettatura di timo e vascolarizzazione del cuore e le cellule perivascolari per criosezioni (Continua dalla sezione 1, punto 7)
- 'Flash congelare' embrione intero in azoto liquido. Gli embrioni possono essere e conservati a -80 ° C fino al momento dell'analisi.
- In alternativa, sezionare fuori timo, sciacquare in 4 ° C PBS, e fissare in 2 ml paraformaldeide 4% (PFA) / PBS per 2 ore. Lavare 3 volte per 10 minuti in PBS freddo, posto Thymi in ottobre, e congelare e conservare fino al momento dell'uso a -80 ° C.
- Per criosezionamento, diffusione ottobre su 'block' una sezione e montare l'embrione o di organi sezionati / tessuti per sezionamento.
- Tagliare tessuti congelati in 10 sezioni micron di spessore e raccogliere su vetrini.
- Fix sezioni in acetone per 5-10 minuti. Lavare 3 volte in TBS freddo.
- Blocco in asino siero del 10% / TBS in una camera umida a temperatura ambiente.
- Incubare sezioni per 1 ora, durante la notte con 100 ml di anticorpi primari in una camera umida a 4 ° C: in questo esempio, utilizziamo ratto anti-CD31 topo (1:100) all'endotelio etichetta, e di capra anti-topo PDGFR-β (1:100) per etichettare le cellule perivascolari. E 'utile per coprire le diapositive con le strisce Parafilm tagliati singolarmente per garantire che l'anticorpo è uniformemente diffuso in tutta la sezione.
- In seguito a incubazione con anticorpo primario, lavare le sezioni 3 volte in TBS freddo. Incubare con 100 ml di appropriati anticorpi secondari per 30 minuti minimo.
- Lavare 3 volte in TBS freddo. Aggiungere 100 ml di montaggio di mezzi di ogni diapositiva e un vetro di copertura.
- Lasciare i vetrini si asciughino in una zona di conservazione al buio.
- Passare alla sezione 'acquisizione di immagini'.
4. Multi-color etichettatura di timo vasi e cellule perivascolari per le sezioni vibratome (Continua dalla sezione 1, punto 7)
- Sezionare i lobi del timo dall'embrione e lavare in PBS freddo.
- Fissare timo nel 4% PFA / PBS a temperatura ambiente per 2 ore.
- Lavare in PBS-Triton X (0,15%) 3 volte, 10 minuti e Thymi posto in una cartuccia di plastica e immergere nel 4% bassa temperatura di fusione agarosio / PBS (~ 4 ° C). Il timo deve essere in contatto con il fondo della cartuccia.
- Lasciare solidificare agarosio su ghiaccio (3-5 minuti). Utilizzare una lama di rasoio per tagliare l'eccesso di agarosio. Aggiungere la colla al blocco vibratome e aderire al blocco del campione.
- Aggiungi PBS freddo vibratome a bagnomaria fino a quando il campione e la lama sono immersi.
- Impostare la velocità e l'ampiezza (ampiezza alta e bassa-moderata velocità è ideale per le sezioni morbide timo). L'ampiezza dovrebbe essere ridotto se le sezioni rompere a causa di agitazione in eccesso.
- Taglio del 50 sezioni um.
- Utilizzando un pennello, raccogliere le sezioni di un 24-bene micropiastre in PBS freddo.
- Sezioni di blocco in 500 ml di siero di asino al 10% in PBS-Triton X (0,15%) per 30 minuti.
- Sezioni incubare per 8 ore a notte con l'anticorpo primario, come anti-CD31 e anti-PDGFR-β, In una coperta di 24 e micropiastre.
- Lavare 3 volte in PBS-Triton X (0,15%) su un totale di 8 ore a 4 ° C.
- Sezioni di blocco nel siero asino 10% in PBS-Triton X (0,15%) per 30 minuti.
- Incubare sezioni per 8 ore per notte a 4 ° C con anticorpi secondaria appropriata.
- Lavare 3 volte in PBS-Triton X (0,15%) su un totale di 8 ore a 4 ° C.
- Ri-fix campioni nel 4% PFA / PBS per 30 minuti in ghiaccio.
- Lavare 3 volte in PBS-Triton X (0,15%) più di 30 minuti sul ghiaccio.
- Disidratare campioni attraverso un graduale MeOH / PBS-Triton X serie: 25% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH, e 100% MeOH a 10 minuti per ogni passaggio. Sostituire il 100% MeOH con MeOH fresca dopo 10 minuti e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- In un contenitore di vetro, mescola BABB (Benzyl Alcohol: Benzyl Benzoate) in un rapporto 1:2. Combina BABB con MeOH per una concentrazione finale del 50% e 50% BABB MeOH. Incubare il campione in BABB: MeOH per 10-15 minuti.
- Trasferimento del campione a un contenitore di vetro con% BABB 100 e incubare per 10-15 minuti o finché non viene chiusa, a temperatura ambiente.
- Compila scivolo depressione (0,7 millimetri di profondità) con fresca BABB 100% e di trasferimento del campione a lato. Aggiungi coperchio in vetro (n. 1.5) e sigillare con 2-3 mani di smalto. Lasciare smalto per indurire al buio a temperatura ambiente, quindi memorizzare campione a 4 ° C.
Nota: Le diapositive devono essere completamente sigillati prima di acquisizione di immagini confocale. Le immagini devono essere acquisite entro 12-24 ore, come i coloranti fluorescenti possono sbiadire a Babb. - Passare alla sezione 'acquisizione di immagini'.
5. Acquisizione di immagini
- Immagine 10 micron sezioni congelate con un microscopio confocale utilizzando il Plan-Apochromat 20X/0.8 obiettivo (512 x 512 pixel) con 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4), 543 - e 633-nm linee laser.
- Acquisire confocale z-sezioni di pelle monte intero e 50 micron agarosio-embedded sezioni utilizzando il Plan-Apochromat 10X/0.4 obiettivo (512 x 512 pixel) con 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4), 543 -, e 633-nm linee laser. Serie Z-sezioni devono essere raccolti in sequenza al numero 1-micron per ogni rispettivo canale.
- Ricostruire serie Z-sezioni utilizzando Zeiss AxioVision 4.6 o altri software di analisi dell'immagine.
6. Rappresentante dei risultati:
Efficace di etichettatura dei vasi embrionali è fondamentale per valutare i difetti dei vasi sanguigni nei topi embrionale. La figura 1 mostra l'etichettatura specifica E16.5 vasi sanguigni del timo (1A-B) e co-marcatura con CD31 (1B), oltre alla colorazione dei ventricoli destro e sinistro (1E-F), rispettivamente. Il GSL I-isolectin B 4 protocollo per criosezioni come descritto nelle sezioni 1, 3 e 5 è stato usato in questi esperimenti. Tutto-mount etichettatura della rete dei vasi sanguigni della pelle su E16.5 topi, utilizzando i protocolli descritti nelle sezioni 1, 2 e 5 è mostrato nella figura 1C-D.
Figura 1 Legend. FITC GSL I - isolectin B 4 iniezioni in vena facciale E16.5 embrioni di topo. Cryosection a. timo embrionale dopo l'iniezione. b. Fusione di CD31 co-etichettatura con isolectin B 4. c. e d. Whole-mount dell'iniezione embrionale vascolarizzazione della pelle successivo. e. ed f. Cryosection embrionale di cuore e. (a destra ventricolo) f. (ventricolo sinistro) dopo l'iniezione.