Cambiare la direzione e l&#39;orientamento del campo elettrico durante l&#39;applicazione impulsi elettrici migliora il trasferimento plasmidi Gene In vitro</em

Sommario

Trasfezione genica mediante elettroporazione è migliorato di circa due volte quando l'orientamento del campo elettrico viene modificato durante l'applicazione di impulsi, mentre la vitalità cellulare non è interessato. L'aumento della transfezione genetica è causata dalla crescita dell'area membrana che è competente per l'ingresso del DNA nella cellula.

Abstract

Gene electrotransfer è un metodo fisico usati per fornire i geni nelle cellule mediante l'applicazione di impulsi elettrici brevi e intensi, che causano destabilizzazione della membrana cellulare, rendendo permeabili a molecole piccole e permette il trasferimento di grandi molecole come il DNA. Rappresenta un'alternativa ai vettori virali, grazie alla sua sicurezza, efficacia e facilità di applicazione. Per gene electrotransfer diversi protocolli di impulsi elettrici vengono utilizzati al fine di ottenere il massimo transfezione genica, uno di loro sta cambiando la direzione del campo elettrico e l'orientamento durante la consegna degli impulsi. Cambio di direzione del campo elettrico e l'orientamento aumentare la superficie della membrana competente per l'ingresso del DNA nella cellula. In questo video, dimostriamo la differenza di efficacia gene electrotransfer quando tutti gli impulsi sono consegnati nella stessa direzione e quando gli impulsi vengono consegnati alternativamente cambiando la direzione del campo elettrico e l'orientamento. A questo scopo punta con elettrodi integrati e ad alta tensione prototipo di generatore, che permette di cambiare di campo elettrico in diverse direzioni durante l'applicazione di impulsi elettrici, sono stati utilizzati. Gene efficacia electrotransfer è determinato 24 ore dopo l'applicazione di impulsi come il numero di cellule che esprimono la proteina fluorescente verde divisa con il numero di tutte le cellule. I risultati mostrano che la transfezione genica è aumentata quando l'orientamento del campo elettrico durante la consegna degli impulsi elettrici è cambiato.

Protocollo

1. Coltura cellulare, il plasmide e la preparazione del buffer per l'esperimento

1. In questo esperimento le cellule ovariche di criceto cinese (CHO-K1) sono utilizzati. Le cellule sono coltivate in una miscela di nutrienti HAM-F12 (PAA) integrato con 2 mM di L-glutamina, 10% di siero fetale bovino, 400 microlitri / l gentamicina (tutti da Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Germania), e 1 ml / l crystacilin (Pliva, Zagabria, Croazia). Le cellule sono conservate a 37 ° C in un umidificata al 5% CO ₂ nell'atmosfera nell'incubatrice per 24 ore.
2. Amplificare plasmide pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA, USA) che codifica per la proteina fluorescente verde (GFP) in DH5α ceppo di Escherichia coli e isolare con HiSpeed ​​plasmidi Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Germania). Concentrazione di DNA plasmide (plasmide disciolti in tampone TE) dovrebbe essere determinata spettrofotometricamente a 260 nm e confermato mediante elettroforesi su gel.
3. Preparare isoosmolar tampone fosfato di sodio (10 mM Na ₂ HPO _4, 10 mM NaH ₂ PO _4, 1 mM _MgCl2, 250 mM saccarosio, pH 7,4).
4. Il giorno di esperimento preparare sospensione cellulare da tripsinizzazione con il 0,25% tripsina / EDTA (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Germania). Centrifugare le cellule per 5 min a 1000 rpm (180 xg) a 4 ° C (Sigma, Germania) e risospendere pellet di cellule in tampone isoosmolar fosfato di sodio per una densità cellulare di 5 × 10 ⁶ cellule / ml.

2. Dotazione hardware

1. Le cellule sono esposte a campo elettrico in puntale (Figura 1) con elettrodi integrata collegata ad un generatore ad alta tensione prototipo. La punta e la geometria di elettrodi permette l'applicazione della relativa omogeneità di campo elettrico e il generatore permette la consegna di impulsi elettrici in direzioni diverse. La punta e il generatore sono stati sviluppati presso il Laboratorio di Biocybernetics, Facoltà di Ingegneria Elettrica, Università di Lubiana ^1.

Figura 1. Verticale e orizzontale (a), sezione fotografia e (b), della punta della pipetta con elettrodi integrati. Nella sezione colore grigio è utilizzato per la custodia in plastica e nero per gli elettrodi. La punta della pipetta con elettrodi integrato è costituito da quattro elettrodi barra cilindrica. Gli elettrodi sono in acciaio inox, il loro diametro è di 1,4 mm, elettrodi adiacenti sono 1 mm l'una dall'altra, e gli elettrodi opposti sono 2 mm. Gli elettrodi sono incollate in punta di plastica in parallelo e la loro lunghezza applicabile è di 30 mm ^2.

3. Gene electrotransfer protocollo

1. Aggiungi plasmide pEGFP-N1 ad una sospensione di cellule in concentrazione di 10 mcg / ml.
2. Incubare la miscela per 2-3 minuti a temperatura ambiente, prima di applicare gli impulsi elettrici.
3. Aspire 100 l di sospensione cellulare in la punta della pipetta con elettrodi integrati.
4. Per ottenere il miglior efficacia electrotransfer genica e mantenere la vitalità cellulare, i parametri ottimali di impulsi elettrici devono essere utilizzati. In questo esperimento un treno di 8 impulsi rettangolari (ciascuno con durata di 1 ms, ampiezza 225 V a 1 Hz, frequenza di ripetizione) è applicato a ciascun campione, utilizzando ad alta tensione del generatore prototipo. Due differenti protocolli di campo elettrico (Figura 2) sono utilizzati: in primo protocollo tutti gli impulsi sono consegnati nella stessa direzione, mentre nel secondo protocollo impulsi vengono consegnati cambiando alternativamente la direzione del campo elettrico e l'orientamento. Il secondo protocollo può essere utilizzato solo con generatore di impulsi appropriati, che consente l'applicazione di impulsi elettrici in direzioni diverse.
5. Immediatamente dopo l'applicazione di impulsi trasferimento alle cellule di puntale in 6 pozzetti e aggiungere siero fetale bovino (FCS-Sigma, USA) (25% del volume del campione).
6. Incubare le cellule per 5 minuti a 37 ° C per consentire una nuova chiusura della membrana cellulare.
7. Aggiungere 2 ml di HAM-F12 per ogni campione in 6 bene e incubare le cellule per 24 ore a 37 ° C in un umidificata al 5% CO ₂ nell'atmosfera nell'incubatrice.

. Figura 2 protocolli di campo elettrico: (a) tutti gli impulsi sono consegnati nella stessa direzione, (b) gli impulsi vengono consegnati alternativamente cambiando la direzione del campo elettrico e l'orientamento.

4. Acquisizione di immagini e la determinazione di efficacia gene electrotransfer

1. L'efficacia del gene electrotransfer è determinato come percentuale di cellule che esprimono GFP 24 ore dopo l'applicazione di impulsi.
2. Le cellule sono osservati utilizzando un microscopio a fluorescenza (nel nostro caso Zeiss 200, Axiovert, ZR Germania) con luce di eccitazione a 488 nm generata con un sistema monocromatore (policromia IV, Visitron, Germania) e di emissione è rilevata a 507 nm. Le immagini vengono registrate con sistema di imaging (MetaMorph sistema di imaging, Visitrsu, Germania), ma altri software di acquisizione simili possono anche essere utilizzati.
3. Acquisire almeno cinque immagini (contrasto di fase e fluorescenza verde) a 20x obiettivo.
4. Contare le celle in immagini a contrasto di fase e le cellule che esprimono GFP in verde immagine fluorescenza. Determinare la percentuale di efficacia gene electrotransfer dividendo il numero di cellule che esprimono GFP con il numero di tutte le cellule in ogni immagine corrispondente (Figura 3).

5. Rappresentante dei risultati:

Figura 3. La percentuale di cellule che esprimono GFP, quando tutti gli impulsi sono consegnati nella stessa direzione e quando gli impulsi vengono consegnati alternativamente cambiando la direzione del campo elettrico e l'orientamento è presentato. Cellule sono state esposte ad un treno di otto impulsi di ampiezza 225 V, durata 1 ms e frequenza di ripetizione di 1 Hz. Risultati sono stati ottenuti mediante microscopia a fluorescenza. Ogni valore nel grafico rappresentano media di tre esperimenti indipendenti ± deviazione standard. Cambiando la direzione del campo elettrico e l'orientamento della percentuale di cellule che esprimono GFP aumenta.

Discussione

Gene electrotransfer è una tecnica biotecnologica versatile che consente il trasferimento del DNA nelle cellule mediante l'applicazione di brevi impulsi elettrici ad alta tensione ³ e rappresenta una alternativa più sicura di vettori virali per la sua sicurezza, efficacia e facilità di applicazione. Anche se gene electrotransfer oggi è ampiamente utilizzata per trasfettare tutti i tipi di cellule e prima fase io studio clinico con questo metodo è stato segnalato ^4, i meccanismi alla base non so...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
HAM-F12	PAA	E15-016	terreno di coltura
L-glutammina	Sigma-Aldrich	G7513
siero fetale bovino	PAA	A15-151
gentamicina	Sigma-Aldrich	G1397	antibiotico
crystacilin	Pliva	625110	antibiotico
pEGFP-N1	Clontech Laboratori	6085-1	DNA plasmidico
HiSpeed ​​Kit Maxi plasmidi	Qiagen	12662
Na 2 HPO 4	Merck	F640786 933
NaH 2 PO 4	TKI Hrastnik	0795
MgCl 2	Sigma-Aldrich	M-8266
saccarosio	Sigma-Aldrich	16104
tripsina / EDTA soluzione	Sigma-Aldrich	T4174
puntale	Una soluzione su misura
generatore di impulsi elettrici	Una soluzione su misura
6 pozzetti	TPP	92406
Centrifuga da 15 ml tubo	TPP	91015
75 centimetri 2 cultura fiasco	TPP	90076