Analisi della migrazione cresta neurale cellulare Trunk con un Modified Zigmond Assay Camera

Summary

Un approccio per analizzare la migrazione delle cellule espiantate (cellule della cresta neurale tronco) è descritto. Questo metodo è poco costoso, delicato, e in grado di distinguere la chemiotassi sia da chemochinesi e altre influenze sulla polarità dei migratori come quelli derivati ​​da interazioni cellula-cellula all'interno della principale coltura cresta neurale delle cellule del tronco.

Abstract

Cellule della cresta neurale (CNC) sono una popolazione transitoria di cellule presenti nello sviluppo dei vertebrati che emigrano dal tubo neurale dorsale (NT), dopo aver subito un epitelio-mesenchimale ^1,2 transizione. A seguito di EMT, CNC migrare grandi distanze lungo percorsi stereotipati fino a raggiungere i loro obiettivi. CNC differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule tra cui i neuroni, glia, melanociti e cellule cromaffini ^1-3. La capacità di CNC di raggiungere e riconoscere i loro percorsi di destinazione corretta è fondamentale per la formazione adeguata di tutte le strutture contenenti tronco NCC-derivato componenti ^3. Chiarire i meccanismi di orientamento per la linea esterna NCC la migrazione è stata quindi una questione di grande importanza. Numerose molecole hanno dimostrato di guidare la migrazione NCC ^4. Per esempio, CNC tronco sono noti per essere respinti da stimoli negativi come orientamento semaforina, efrina, e leganti a fessura ^5-8. Tuttavia, nonfino a poco tempo eventuali fattori chemiotattici di CNC tronco stati identificati ^9.

Convenzionale negli approcci in vitro per lo studio del comportamento chemiotattico di cellule aderenti funzionare al meglio con le cellule immortalizzate, omogeneamente distribuiti, ma sono più difficili da applicare alle colture primarie di cellule staminali determinate che inizialmente non hanno una distribuzione omogenea e differenziano rapidamente (ad esempio CNC). Un approccio per omogeneizzare la distribuzione di CNC tronco per gli studi di chemiotassi è quello di isolare CNC tronco da colture primarie di espianti NT, quindi sollevare e replate loro di essere quasi al 100% confluenti. Tuttavia, questo approccio placcatura richiede notevoli quantità di tempo e fatica per espiantare numero sufficiente di cellule, è dura, e distribuisce CNC tronco in modo dissimile da quella che si trova nelle condizioni in vivo.

Qui, segnaliamo un approccio in vitro che è in grado di valutare le risposte migratori chemiotassi e altre NCCs tronco senza requiringa distribuzione omogenea delle cellule. Questa tecnica utilizza time-lapse imaging di primario, imperturbabile CNC tronco all'interno di una Zigmond modificato camera (una camera standard di Zigmond sono descritti in un ^10). Esponendo NCCs tronco alla periferia della coltura di un gradiente chemotactant che è perpendicolare alla loro direzionalità predetto naturale, alterazioni polarità migratori indotti dal gradiente chemotactant applicata può essere rilevato. Questa tecnica è poco costoso, richiede la coltura di due soli espianti NT per trattamento replica, evita sollevamento dura cellule (come tripsinizzazione), lascia NCCs tronco in una distribuzione più simile a condizioni in vivo, riduce la quantità di tempo tra espianto e sperimentazione (probabile che riduce il rischio di differenziazione), e permette time-lapse valutazione di numerose caratteristiche migratori.

Protocol

1. Giorno 1: Isolamento di tubi tronco neurali per la cultura durante la notte su vetrini

1. Incubare le uova pulcino per 56 ore a 38 ° C. Togliere le uova da incubazione, leggermente spruzzateli con etanolo al 70%, e poi lasciarle asciugare. Rompete le uova si schiudono in un vassoio di vetro UV-sterilizzati.
2. Estrarre ogni embrione dal suo uovo e metterlo nella pulcino Ringer. A tale scopo, primo taglio circa le sue isole di sangue con le forbici curve, poi, con una pinza smussato, prendere l'embrione dal suo membrana extraembrionale e metterla in un piatto di plastica sterile Petri contenente la soluzione di Ringer pulcino.
3. Isolare il tr....

Discussion

Condurre ricerche sulla chemiotassi CNC tronco si è dimostrato difficile per una serie di ragioni. CNC Trunk costituiscono una eterogenea popolazione di cellule staminali che si differenziano, se coltivate a lungo termine, pertanto, CNC tronco devono essere ottenuti da espianto primario del tronco a livello di NT. I metodi convenzionali per studiare la risposta chemiotattica di popolazioni cellulari distribuiti omogeneamente in vitro sono difficili da testare su NCCs tronco dal loro primo richiedono che le cell.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
DMEM	Omega scientifico	DM-22
Penicillina Streptomicina Soluzione	Omega scientifico	PS-20	Archivio concentrazione 100X
L-Glutammina	Omega scientifico	GS-60	Archivio concentrazione 100X
Siero fetale bovino	Omega scientifico	FB-11	Lot # 105247 (o un altro che è comparabile)
Modificata Zigmond camera	Fatto in casa	N / A	Capacità serbatoio: ~ 160 microlitri bis, per le altre specifiche, vedi fig. 4 e il protocollo di fabbricazione supplementare
Colture cellulari piatto	Denville	T6040	40 x 10 mm
Fibronectina	BD	354008	Stock 10x prepped diluendo 1 mg FN in 1 ml H 2 O e 9 ml DMEM
Coprioggetto	Pescatore	12-548-B	Prefiltrata, 22 x 22 mm
L15 media	Thermo Scientific	SH30525.02
Vaselina	Comforts	011110794642	100%
Centrifuga tubo	Biologix	10-9152	15 ml
Dispasi	Sistemi cellulari	4Z0-850	Archivio concentrazione 10X
Siringa	BD	309602	1 ml
Ago	BD	305127	25 G x 1,5 pollici
Alexa Fluor 488-IgM	Ionvitrogen	A21042	Foto è di 2 mg / ml; 7 moli colorante / mole IgM
Pinze per dissezione	FST	Varie.	Dumont # 5 o 55; dritto a punta, in acciaio inox o in titanio
Tungsten Needle	N / A	N / A	Fatta in casa, posto in un supporto del perno
Blunt Pinze	Tiemann	160-18	Usato per il trasferimento di embrioni di Ringer da tuorlo d'uovo