Un test funzionale di sangue intero per misurare la vitalità dei micobatteri, utilizzando Reporter-Gene Tagged BCG o M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Sommario

Abbiamo descritto un approccio alternativo alla enumerazione dei micobatteri In vitro, Che utilizza giornalista-gene tag micobatteri invece di unità formanti colonie (CFU). "Sopravvivenza" degli organismi così come risposta dell'ospite-marcatori vengono misurati contemporaneamente, fornendo un basso costo, sistema versatile e funzionale per gli studi di host / patogeno interazioni nel contesto della tubercolosi.

Abstract

Test funzionali hanno a lungo avuto un ruolo chiave nella misurazione di immunogenicità di un vaccino somministrato. Questo è convenzionalmente espresso in titoli battericida del siero. Studi di siero titoli battericida in risposta a vaccini per l'infanzia ci hanno permesso di sviluppare e convalidare i livelli di cut-off per la risposta immunitaria protettiva e tale cut-off sono in uso di routine. Nessun tali analisi sono state prese in avanti nella valutazione di routine dei vaccini che inducono soprattutto immunità cellulo-mediata in forma di risposte delle cellule T effettrici, come i vaccini TB. Nel modello animale, le prestazioni di un candidato vaccino somministrato di routine è valutato in test standardizzati battericida, e tutti gli attuali romanzo TB-vaccino candidati sono stati sottoposti a questo passo nella loro valutazione prima della fase 1 sperimentazione umana. La valutazione di immunogenicità e quindi probabilità di efficacia protettiva del romanzo di vaccini anti-TBC dovrebbe idealmente subire una simile graduale valutazione nei modelli umani oggi, comprese le misurazioni in saggi battericida.

Test battericida nel contesto della ricerca tubercolosi vaccino sono già ben radicate nei modelli animali, dove sono applicati a schermo vaccini candidati potenzialmente promettenti. Riduzione della carica batterica nei vari organi funzioni come il principale lettura di immunogenicità. Tuttavia, non tali dosaggi sono stati inseriti nella sperimentazione clinica per il romanzo anti-TB vaccini fino ad oggi.

Anche se c'è ancora incertezza circa i meccanismi esatti che portano alla morte dei micobatteri all'interno dei macrofagi umani, l'interazione dei macrofagi e delle cellule T con micobatteri è chiaramente necessario. Il dosaggio descritti in questo documento rappresenta una nuova generazione di test battericida che consente studi di tali componenti chiave cellulari con tutti gli altri fattori cellulari e umorali presenti nel sangue intero senza fare ipotesi sulla loro contributo relativo individuali. Il test descritto dal nostro gruppo utilizza piccoli volumi di sangue intero ed è già stato impiegato in studi di adulti e bambini in TB è endemica impostazioni. Abbiamo dimostrato immunogenicità del vaccino BCG, aumento della crescita dei micobatteri in pazienti sieropositivi, così come l'effetto della terapia anti-retrovirale e vitamina D sulla sopravvivenza dei micobatteri in vitro. Qui riassumiamo la metodologia, e presentare i nostri dati riproducibilità utilizzando questo modello relativamente semplice, a basso costo e di campo-friendly.

Nota: Definizioni / Abbreviazioni

BCG lux = M. bovis BCG, ceppo Montreal, trasformato con il plasmide pSMT1 navetta che trasportano i geni luxAB dal Vibrio harveyi, sotto il controllo dei micobatteri GroEL (hsp60) promotore.
UFC = unità formanti colonia (una misura della vitalità dei micobatteri).

Protocollo

1. Preparazione del giornalista BCG magazzino lux micobatteri

1. Crescere BCG lux (M. bovis BCG ceppo Montreal trasformato con il plasmide pSMT1 navetta) con agitazione a 200gpm a metà logaritmica fase Middlebrook 7H9 brodo glicerolo contenente 0,2%, 0,05% Tween 80 e il 10% di arricchimento ADC.
2. Preparare 1 ml di una diluizione 1:10 di cultura BCG lux in PBS sterile in un tubo luminometro (900μl PBS + 100μl BCG cultura lux) in duplice copia.
3. Carico provetta contenente N-decile aldeide (substrato dell'enzima luciferasi) sul retro della macchina e garantire il coperchio è assicurato e tubi in posizione.
4. Primo luminometro iniettore con substrato tramite il programma principale, insieme a iniettare 100 UCL x 3 in ciascuno dei 3 tubi adescamento vuoto posto nel luminometro.
5. Caricare il 2 tubi in luminometro e le letture tramite un programma fissato a iniezione di 100 UCL di substrato in ogni provetta e leggere per 20 secondi in intervalli di 1 sec.
6. Quando lo stock ha raggiunto 1x10 ⁸ RLU / ml a 2x10 ⁸ RLU / ml (questo dura circa 3-4 giorni di crescita), aggiungere un uguale volume di glicerolo sterile al 30% alla cultura in un tubo da 50 ml falco e mescolare delicatamente.
7. Aliquota 1,5 ml volumi in etichetta 2 ml con tappo a vite microtubo e conservare a -80 ° C.

2. Determinazione magazzino RLU / CFU correlazione e contenuti di aliquote

1. Aggiungere 15 ml di media cultura Middlebrook 7H9 con supplemento del 10% ADC ad una beuta da 200 ml con un tappo ventilato.
2. Aggiungere 15μl di Hygromycin e 30μl di Tween 20%.
3. Rimuovere una fiala di BCG lux dal freezer e scongelare a temperatura ambiente (RT) nel gabinetto di sicurezza. Aggiungere il contenuto della fiala al mezzo e serrare il tappo.
4. Incubare con agitazione a 200gpm a 37 ° C per 4 giorni.
5. Ogni giorno, make up di serie 10-diluizioni (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000 e 1:100.000) per la determinazione CFU.
6. Impostare le diluizioni stesso in parallelo e duplicare per determinare luminescenza (cfr. parte 1,2-1,6).
7. Preparare due 3-vano piastre di agar Middlebrook 7H11 (1 l di liquido contenente 0,5% glicerolo, supplemento del 10% OADC, 1 ml di Tween 20% e 1 ml di Hygromycin).
8. Piastra in 100μl di ciascuna diluizione su un segmento di ogni piatto con crocette separati, distribuendo il liquido equamente tra la camera singola.
9. Sigillare ogni piatto con parafilm, mettere in un sacchetto di plastica sterile, sigillare con nastro autoclave, e incubare a 37 ° C per 2 settimane con i coperchi rivolti verso il basso.
10. Ispezionare regolarmente fino CFU apparire (2-3 settimane).
11. Per contare le colonie, rimuovere le piastre dal termostato e posto su un bancone colonia. Calcolare la media per ogni diluizione dalle piastre duplicato.
12. Calcolare la RLU / CFU rapporto con equivalente RLU e conta CFU per ogni diluizione. Il rapporto dovrebbe essere tra 3 e 5 RLU / CFU.

3. Preparazione della cultura BCG lux per inoculazione in sangue intero

1. Aggiungere 15 ml di media cultura Middlebrook 7H9 con supplemento del 10% ADC ad una beuta da 200 ml con un tappo ventilato.
2. Aggiungere 15μl di Hygromycin e 30μl di Tween 20%.
3. Rimuovere una fiala di BCG lux dal freezer e scongelare a temperatura ambiente nel gabinetto di sicurezza. Aggiungere il contenuto della fiala al mezzo e serrare il tappo.
4. Incubare con agitazione a 200gpm a 37 ° C per 2 a 4 giorni.
5. Preparare 1 ml di una diluizione 1:10 di cultura BCG lux in PBS sterile in un tubo luminometro (900μl PBS + 100μl BCG cultura lux) in duplice copia.
6. Luminometro primo con il substrato (come descritto sopra), delicatamente vortice i 2 tubi e caricare nel luminometro e le letture (come descritto sopra).
7. Utilizzare questa lettura per diluire in basso la cultura in PBS per dare un equivalente di 7x10 ⁶ RLU (questo darà un inoculo di circa 2x10 ⁵ CFU / ml di sangue e un rapporto di BCG a monociti di circa 1:1, assumendo un conteggio dei monociti di circa 2x10 4x10 ⁵ a ⁵ monociti per ml di sangue).

4. Preparazione di sangue intero

1. Da 3 a 5 ml di sangue venoso in una provetta contenente eparina senza conservanti.
2. Trasferire il sangue in una provetta da 50 ml falco e diluire con un uguale volume di RPMI 1640 contenente HEPES glutammina e 25 mm (senza pen / strep).
3. 900μl aliquota di sangue diluito in triplice copia in tubi sterili bijou per ogni punto temporale (6 tubi in totale:. 0ore e 3 per 3 per 96hrs Istituito tubi aggiuntivi per timepoints aggiuntive, se necessario.
4. 900μl aliquota di terreno di coltura Middlebrooks 7H9 con il 10% ADC + supplemento 50μg/ml Hygromycin (lo stesso mezzo utilizzato per la cultura lux BCG) in duplice copia per i controlli di crescita.
5. Aggiungere 100μl della diluito BCG lux a ciascuna provetta di sangue, e per il controllo 2 crescitatubi.
6. Mescolare bene e posto le 3 bijous per la 96hr time-point e le 2 controlla la crescita al loro fianco in incubatrice a dondolo a 37 ° C, 20 giri / min (CO ₂ non richiesto).

5. Luminescenza di misura (a 0hr e 96hrs)

1. Centrifugare i 3 bijous a 2000g per 10 min.
2. Rimuovere con cura 300μl di sopranatante senza disturbare il pellet e il luogo in 2 ml con tappo a vite microtubi di congelare a -80 ° C per l'analisi delle citochine successive.
3. Aggiungere 300μl di PBS in ogni bijou per sostituire il volume del surnatante eliminato.
4. Aspirare il contenuto di ogni bijou nel corrispondente tubo 50ml falco e aggiungere 8 ml di acqua distillata ad ogni provetta. Iniziare un timer per 10 minuti.
   Nb: Questo è un tempo sensibile al passo, e questo incubazione non deve essere più di 10 minuti, a partire da quando le prime cellule entrano in contatto con l'acqua.
5. Sciacquare ogni bijou con 2 ml di acqua distillata e vortex per 5 secondi prima di ribaltamento nel tubo corrispondente falco.
6. Al termine della incubazione di 10 minuti, centrifugare i tubi falco a 2000g per 10 minuti.
7. Surnatante decantare in disinfettante Surfanios.
8. Aggiungere qualche granello di ogni pellet e vortice.
9. Aggiungere 1 ml di PBS sterile per ciascuna provetta e vortex.
10. In tubi luminometro, fare diluizioni 1:10 per ogni campione in duplicato con PBS (PBS 900μl campione + 100μl) e al 96hr time-point. Effettuare le diluizioni stesso per ciascuno dei controlli crescita.
11. Delicatamente vortice i tubi e caricare nel luminometro e le letture (come descritto sopra)
    Nb: Letture tra triplica dello stesso campione dovrebbe essere entro il 15% l'uno dall'altro.

6. Rappresentante dei risultati:

E 'importante usare i batteri in fase logaritmica di crescita per le analisi del sangue intero lux, cioè cresciuta negli 48-72 ore prima di inoculare i campioni, in quanto l'attività metabolica è sub-ottimale se uno fuori direttamente dal freezer o in fase stazionaria. La crescita preventiva deve essere standardizzato per una serie di esperimenti sia a 48 o 72 ore per evitare la variabilità. La figura 1 mostra la curva di crescita di una cultura rappresentante della BCG lux. Il tempo di raddoppio è di circa 24 ore fino a quando la fase stazionaria è raggiunto.

Figura 1. Curva di crescita rappresentante di BCG lux oltre 96 ore in media 7H9 e la correlazione di RLU e CFU.

Anche se i valori RLU sempre correlate con CFU, il numero di RLU CFU corrispondenti ad un singolo può variare a seconda del magazzino, che è il motivo per cui è buona norma utilizzare le azioni stesse congelato tutta una serie di esperimenti per garantire una molteplicità consistente di infezione ( MOI).

La tabella 1 mostra un esempio di data crudo al momento della vaccinazione (T ₀₎ e in 96 ore. I rapporti di crescita sono calcolati utilizzando la formula T ₉₆ / T _0, ma intervalli di tempo gli altri possono naturalmente anche essere misurata. E ', tuttavia, non consiglia di utilizzare le culture oltre 96 ore, come la morte cellulare si verifica una significativa.

Tabella 1. Esempio di dati grezzi al momento dell'inoculazione (T0) ed a 96 ore (T96) e rapporti di crescita calcolato da 3 donatori adulti.

A seconda della disposizione antigene-specifiche risposte della memoria e forse conta anche dei neutrofili, i rapporti di crescita variano da individuo a individuo, come mostrato nella Figura 2 nel sangue dei bambini con e senza infezione da HIV. In media, i bambini piccoli hanno rapporti di crescita maggiori rispetto agli adulti, test cutaneo alla tubercolina (TST) + ve individui hanno rapporti di crescita inferiore rispetto TST-ve gli individui, e pazienti affetti da HIV hanno rapporti di forte crescita dovuta al deficit della popolazione di cellule T CD4, uno dei mediatori chiave della risposta immunitaria cellulare per micobatteri.

Figura 2 Inter-donatore variabilità:. Crescita del rapporto T ₀ contro 96 ore per una serie di pazienti, a seconda del sottostante stato di sieropositività.

Riproducibilità dei rapporti di crescita in un periodo di tempo è mostrato in Figura 3, che riassume i risultati da 64 donatori sanguinato due volte in un periodo di 12 mesi e da un singolo donatore sanguinato ripetutamente per esperimenti di controllo. Potenziali cause di variabilità possono essere cambiamenti nella sensibilizzazione micobatteriche o variabilità all'interno dei livelli di citochine di accoglienza, come osservato in molti saggi biologici.

Figura 3. (A) donatore singolo a 12 volte nell'arco di 12 mesi. (B) multiple (64) i donatori in 2 occasioni su 12 mesi.

Discussione

Test battericida nel contesto della ricerca tubercolosi vaccino sono ben stabiliti nei modelli animali, dove sono applicati a schermo vaccini candidati potenzialmente promettenti. Riduzione della carica batterica nei vari organi funzioni come il principale lettura di immunogenicità.

La prima generazione di umani test battericida sono stati progettati utilizzando macrofagi da solo, infettati con M. tubercolosi. CFU servita come principale lettura di sopravvivenza dei micobatteri dopo...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagente	Azienda	Nessun gatto
BCG lux	Vari	n / a
Middlebrook 7H11 agar	Becton Dickinson	283810
Middlebrook 7H9 brodo	BD Biosciences	271310 (500g)
Middlebrook ADC arricchimento	BD Biosciences	212352
Middlebrook OADC supplemento	Becton Dickinson	212240
Tween 80	Sigma Aldrich	274364
Glicerina	Sigma Aldrich	G5150
Hygromycin B	Roche	10843555001 (20ml)
N-decile aldeide	Sigma	D7384-100G
Etanolo (> 99,7%)	VWR	101077
PBS sterile	In Casa	n / a
RPMI-1640 con L-Glutamina, HEPES 25mM	Sigma	R0883
Acqua distillata sterile	In Casa	n / a
Attrezzatura
Tubo luminometro (porta iniettabili obbligatorio)	Berthold AutoLumat LB953 o monotubo luminometro Sirius
Tubi luminometro, 12 x 75mm, pyrex senza montatura	Corning VWR	99445-12
Beute con tappi ventilati, sterile in policarbonato 250ml	Corning via Fisher Scientific	2150329
BD Vacutainer il prelievo di sangue Tubi (senza conservanti eparina)	BD	367676
Provette Falcon da 50 ml, conico	BD	352077
7ml Sterilin campione tubi in polipropilene bijou	VWR	99445-12
Sterilin Contenitori universali (30 ml)	Laboratorio di Analisi LTD	128C
Perle di vetro diametro di 2mm	SigmaAldrich	Z143928
10ml pipette e ragazzo pipetta	qualsiasi
1000μl e 200μl pipette e puntali con filtro	qualsiasi
Attrezzatura generale di laboratorio:
Classe II di sicurezza Armadio
Frigorifero (4 ° C)
Centrifuga
Rocking shaker piattaforma (180 0) miscelare tubi
Shaker orbitale incubatore a 37 ° C per crescere colture batteriche