Il sistema di genetica inversa per la Valle del virus della febbre della Rift MP-12 ceppo vaccinale è un utile strumento per la creazione di ulteriori MP-12 mutanti con attenuazione aumentata e l'immunogenicità. Noi descriviamo il protocollo per generare e caratterizzare NSS ceppi mutanti.
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Articolo metodologico
Utilizzando genetica inversa per manipolare il gene del NSS il virus della febbre della Rift Valley MP-12 Strain per migliorare la sicurezza e l'efficacia del vaccino
In questo articolo
Sommario
Abstract
Virus della febbre della Rift Valley (RVFV), che causa febbre emorragica, disturbi neurologici o cecità negli esseri umani, e un alto tasso di aborti e malformazioni fetali nei ruminanti 1, è stata classificata come HHS / USDA sovrapposizione agente di selezionare e di un gruppo di rischio 3 patogeno. Appartiene al genere Phlebovirus nel Bunyaviridae famiglia ed è uno dei membri più virulenta di questa famiglia. Diversi sistemi di genetica inversa per l'MP-12 RVFV ceppo del vaccino 2,3 così come wild-type ceppi RVFV 4-6, tra cui ZH548 e ZH501, sono state sviluppate dal 2006. La MP-12 ceppo (che è un gruppo di rischio 2 patogeno e un non-selezione agente) è fortemente attenuata da diverse mutazioni nel suo M-e L-segmenti, ma porta ancora virulento S-segmento RNA 3, che codifica per una virulenza funzionale fattore, NSS. Il rMP12-C13type (C13type) portando al 69% in-frame cancellazione di NSS ORF manca di tutte le funzioni NSS noto, mentre si replica come efficient così come MP-12 in VeroE6 cellule prive di tipo I IFN. NSS induce una chiusura di trascrizione ospitare tra cui l'interferone (IFN)-beta mRNA 7,8 e promuove la degradazione della doppia elica RNA-dipendente proteina chinasi (PKR) al post-traduzionali livello. 9,10 IFN-beta è trascrizionalmente sovraregolati per il fattore normativo interferone 3 (IRF-3), NF-kB e proteina attivatrice-1 (AP-1), e il legame di IFN-beta di IFN-alpha/beta recettore (IFNAR) stimola la trascrizione di IFN-alfa geni o altri geni dell'interferone stimolata (ISGs) 11, che induce ospitare attività antivirale, mentre la trascrizione soppressione ospiti ivi compresi IFN-beta gene NSS impedisce la upregulations gene di quelli ISGs in risposta alla replicazione virale nonostante IRF-3, NF-kB e attivatore proteina-1 (AP-1) può essere attivata RVFV7. . Così, NSS è un obiettivo eccellente per attenuare ulteriormente MP-12, e per migliorare la risposta immunitaria innata ospitare abolendo l'IFN-beta funzione di soppressione. Qui, Si descrive un protocollo per la generazione di un ricombinante MP-12 NSS codifica mutato, e fornire un esempio di un metodo di screening per identificare i mutanti NSS manca la funzione di sopprimere IFN-beta sintesi di mRNA. Oltre al suo ruolo essenziale nella dell'immunità innata, tipo I IFN è importante per la maturazione delle cellule dendritiche e l'induzione di una risposta immunitaria adattativa 12-14. Così, mutanti NSS indurre IFN di tipo I sono ulteriormente attenuati, ma allo stesso tempo sono più efficienti a stimolare le risposte immunitarie di ospitare wild-type MP-12, che li rende candidati ideali per gli approcci di vaccinazione.
Protocollo
1. Recupero di mutazione ricombinante-12 MP codifica NSS (s) da plasmide DNA 2
- Diffusione renali di criceto neonato (BHK) / T7-9 celle 15, che esprimono stabilmente T7 RNA polimerasi, in 6 cm di piatti in Medium minimo (MEM)-alfa (Invitrogen, Cat # 32561037) contenente il 10% siero fetale bovino (FBS ), penicillina-streptomicina (Penicillina: 100 U / ml, streptomicina: 100 mcg / ml) (Invitrogen, Cat # 15140122), e 600 mg / ml di Hygromycin B (Cellgro, Cat # 30-240-CR).
* L'efficienza di recupero virale è superiore a 6 cm di piatti che in 35 mm piatti. BHK/T7-9 cellule con passaggio basso livello di supporto più alti tassi di recu....
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Discussione
Sistemi di genetica inversa per RVFV sono stati sviluppati da diversi gruppi utilizzando promotore T7 2,4,5 o mouse 3 o umano 4 pol-I promoter. In questo manoscritto, si descrive un protocollo per generare ricombinante RVFV MP-12 ceppi utilizzando BHK/T7-9 15 cellule che esprimono stabilmente T7 RNA polimerasi. L'efficienza di recupero virale varia a seconda delle condizioni di BHK/T7-9 cellule, la quantità di plasmidi, il numero di cellule transfettate e così via. Abbiamo.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato per numero di Grant 5 U54 AI057156-07 tramite Western Centro Regionale di Eccellenza (WRCE), 1 AI08764301 R01-A1 da Istituto Nazionale di Allergologia e Malattie Infettive, e un finanziamento interno da Sealy Centro per lo sviluppo di vaccini presso l'Università di Texas Medical Branch.
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Materiali
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Medium minimo (MEM)-alfa | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco modificato medio minimo indispensabile | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillina-Streptomicina | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Triptosio fosfato brodo | MP Biomedicals | 1682149 | |
| Agar Noble | VWR | 101170-362 | |
| Transit-LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol coperchio stretto | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0,33% soluzione di rosso neutro | Sigma Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT cellule MEF | InvivoGen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | InvivoGen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| Quanti-blu | InvivoGen | rep-QB1 | |
| BHK/T7-9 celle 15 | Gifu University, in Giappone | ||
| Vero E6 cellule | ATCC | CRL-1586 |
Riferimenti
- Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, an....
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Ristampe e permessi
