Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Summary

Il lievito di fissione, Schizosaccharomyces pombe, È un sistema ottimo modello per studiare i processi cellulari di base. Qui si descrive un metodo per eseguire l'analisi quantitativa di cellule vive di lievito di fissione. In questo esperimento particolare ci concentriamo sulla organizzazione del genoma all'interno del nucleo cellulare, ma il metodo può essere utilizzato anche per studiare i fattori citosolici.

Abstract

Tecniche di microscopia Diversi sono oggi disponibili in grado di rilevare una specifica proteina all'interno della cellula. Durante l'ultimo decennio di imaging cellulare dal vivo utilizzando fluorocromi come Green Fluorescent Protein (GFP) direttamente collegato alla proteina di interesse è diventato sempre più popolare ^1. Mediante GFP e fluorocromi simili le localizzazioni subcellulari e dei movimenti delle proteine ​​può essere rilevato in un microscopio a fluorescenza. Inoltre, anche la localizzazione subnucleare di una certa regione di un cromosoma possono essere studiate usando questa tecnica. GFP è fusa alla proteina repressore Lac (LacR) e ectopica espresso nella cella in cui ripetizioni in tandem della sequenza Laco è stata inserita nella regione di interesse sul cromosoma ^2. Il LacR-GFP si legano alle ripetizioni del Laco e quella zona del genoma sarà visibile come un punto verde nel microscopio a fluorescenza. Il lievito è particolarmente adatto per questo tipo di manipolazione perché omologhiricombinazione è molto efficiente e pertanto tale da consentire l'integrazione mirata delle ripetizioni Laco e proteine ​​di fusione progettata con GFP ^3. Qui si descrive un metodo quantitativo per l'analisi di cellule vive di lievito di fissione. Protocolli aggiuntivi per l'analisi di cellule vive di lievito di fissione si possono trovare, ad esempio su come fare un film dei ⁴ meiotico comportamento cromosomiche. In questo esperimento particolare ci concentriamo sulla organizzazione subnucleare e come esso è influenzato durante l'induzione del gene. Abbiamo un cluster etichettati gene, chiamato Chr1, con l'introduzione di siti Laco legame in prossimità dei geni. Il cluster gene è arricchito per i geni che sono indotti precocemente durante la fame di azoto di lievito di fissione ^5. Nel ceppo della membrana nucleare (NM) è etichettato con l'attaccamento alla mCherry Cut11 proteina NM dando luogo a un segnale rosso fluorescente. Il Polo mandrino corpo (SPB) composto Sid4 è fuso Red Fluorescent Protein (Sid4-MRFP) ⁶ 7. SPB è identificato come una grande struttura rotonda nel NM. Per immagini prima e 20 minuti dopo l'esaurimento della fonte di azoto possiamo determinare la distanza tra il cluster gene (GFP) e NM / SPB. Le distanze medie o mediana, prima e dopo l'esaurimento di azoto vengono confrontati e possiamo quindi quantificare se c'è uno spostamento nella localizzazione subcellulare del cluster gene dopo l'esaurimento di azoto.

Protocol

1. Fissione lievito madre

1. Preparare Edimburgo minima Media (EMM) e EMM senza ammoniumchloride (EMM-N) ^8. Per ridurre autofluorescenza la soluzione di glucosio non deve essere sterilizzato in autoclave ma invece filtro sterilizzato usando un filtro di 0,2 micron e, successivamente, aggiunti ai media sterilizzati in autoclave.
2. Inoculare cellule di lievito di fissione appena cresciute su una piastra di agar con rich media, YEA ^8, in 3 ml di EMM liquidi con filtro glucosio sterilizzati. Utilizza tubi 13ml con una leggera spinta sul cappuccio per garantire una buona ventilazione delle celle. Lasciate che le cellule crescono agitando con 225 giri in 30 ° C. Mantenere le cellule crescono in fase di log (1 X 10 ⁶ - 2 X 10 ⁷ cellule / ml) per 2 giorni contando utilizzando una camera di Burker seguito da opportuna diluizione, ogni mattina e sera.
3. Il giorno dell'esperimento assicurarsi di avere cellule in fase di log primi, 5 X 10 ⁶ - 1 x 10 ⁷ cellule / ml.
4. Morire di fame tche le cellule per l'azoto durante i 20 minuti dal passaggio di mezzi di comunicazione EMM EMM-N media. Questo è fatto da 3 ml di raccolta di cellule in una provetta 1,5 ml Eppendorf in una centrifuga da banco al massimo 1,5 rcf come centrifugazione ad una velocità più rapida potrebbe indurre una risposta allo stress nel lievito di fissione ^9. Utilizzare la tecnica doppio filatura, significato, primo giro di 2 minuti, quindi ruotare il tubo Eppendorf 180 ° e far girare di nuovo per 1,5 rcf 2 min ^10. Questo aiuta a raccogliere tutte le celle in una pellet sul fondo della provetta. Lavare una volta con EMM-N e poi sciogliere il precipitato in EMM-N e incubare le cellule per 15 minuti a 30 ° C agitazione a 225 rpm e poi proseguire al punto 2. Preparazione del campione.

2. Preparazione del campione

1. Harvest 1,5 ml di cellule in una provetta da 1,5 ml Eppendorf in una centrifuga da banco al massimo 1,5 rcf come centrifugazione ad una velocità più rapida potrebbe indurre una risposta allo stress nel lievito di fissione ^9. Utilizzare la tecnica doppio filatura, Meaning, primo spin per 2 minuti, quindi ruotare il tubo Eppendorf 180 ° e far girare di nuovo per 1,5 rcf per 2 min ^10. Questo aiuta a raccogliere tutte le celle in una pellet sul fondo della provetta.
2. Rimuovere il surnatante, ma lasciare 10-15 microlitri e risospendere le cellule del materiale rimanente. In alternativa, aggiungere 10 ml di mezzi freschi per risospendere il pellet cellulare.
3. Assicurarsi di avere diapositive in vetro trasparente e copertura in vetro (non 1,5). Normalmente non è necessario pulirli, ma assicurarsi che non sono pieni di polvere.
4. Togliere dal freezer una aliquota di una soluzione madre di lectina 1mg/mL che è stata filtro sterilizzato. La soluzione lectine possono essere ricongelati più volte. La lecitina è usata per fissare le cellule di lievito al vetro di copertura.
5. Mettere 5 ml di glucosio EMM con filtro sterilizzato sul vetro obiettivo.
6. Mettere 5 ml di soluzione di lectina in un angolo del vetro di copertura. Successivamente posto 5 ml di colture cellulari nello stesso angolo, vale a dire il calo lectina. Mescolare pipettando un paio di volte e poi diffondere la coltura cellulare-lectina mix tutto il vetro di copertura, utilizzando il lato lungo del puntale. A seconda della densità della miscela cellule lasciare tutto o aspirare il liquido in eccesso in un angolo opposto del vetro di copertura.
7. Posizionare il vetro di copertura, in alto, con un lato sul vetro obiettivo e l'altro in panchina. Lasciate che il vetro di copertura a secco un po 'per qualche minuto. Non deve assolutamente essere completamente asciutto, ma non dovrebbe essere troppo liquido sul vetro.
8. Posizionare il vetro di copertura con un angelo circa 70 ° rispetto al vetro obiettivo la goccia di EMM. Lasciate andare il vetro di copertura in modo che cada dall'alto verso il basso nella goccia di EMM.
9. Per sigillare i bordi con grasso al silicone preparare una siringa da 2 ml. Tagliare la parte più larga di una punta di 200 l ed allegarlo alla siringa. Riempire la siringa con circa 1 ml di grasso al silicone. Una linea sottile di silicio viene applicato ai bordi del vetro di copertura con delicatezza pushing il pistone della siringa. Ora avete una piccola camera di crescita di S. pombe cellule.

3. Microscopia

1. Inizializzare la microscopia a fluorescenza, attivando il mercurio / lampada allo xeno, il microscopio e il computer. Posizionare la camera di crescita del lievito al microscopio a fluorescenza. Utilizzare un obiettivo 63 X o un 100 X con obiettivo NA = 1.3 o superiore. Se un obiettivo è utilizzato l'olio, aggiungere l'olio.
2. Utilizzare il campo luminoso per trovare le cellule e ottenere una foto nitida.
3. Le impostazioni per la microscopia a fluorescenza variano a seconda del fluorocromi usati per etichettare le cellule di lievito e il microscopio. Usiamo un microscopio confocale Zeiss LSM 700 Microscopio Scansione Laser con Plan-Apochromat lente 63x obiettivo di olio (NA = 1,4) con il 16-linea di impostazione media di scansione aereo. Il foro deve essere impostato a 1-1,1 unità Airy, che dà una fetta ottico di 0,8 mm. Rileviamo GFP in pista 1 usando il set di filtri per Alexa 488 con un divisore di fascio a 582 nm, in modo detecting lunghezze d'onda tra 488 e 582 nm. In pista 2 si usa un set di filtri ottimali per mCherry utilizzando un divisore di fascio a 578 nm, in modo da rilevare le lunghezze d'onda tra 578 e 600 nm. Ciò significa che in traccia 2 sia il MRFP (SPB) e NM (mCherry) verrà rilevato.
4. Prendere come molte immagini dovevano essere in grado di misurare in 60 celle diverse per ogni ceppo. Di solito 15 immagini dei campi di microscopia indipendente sono sufficienti. Si consiglia una camera nuova crescita con cellule fresche viene fatta se il vostro tempo microscopia supera i 60 minuti.

4. Misurazione quantitativa delle distanze subcellulari

1. Aprire le immagini in Zen programma Light Edition Zeiss. Utilizzando lo strumento di misurazione misura la distanza in micron tra i fluorocromi diversi in tutte le celle in cui tutti i segnali sono sullo stesso piano focale. Regolare l'intensità della luce e il contrasto di individuare il centro del segnale fluorescente. Questo protocollo semplificato utilizza solo due diversi cOLORI e quindi la SPB e NM sono nello stesso canale. SPB è individuata dal suo grande struttura rotonda nel NM. Trasferire le distanze a un foglio notepad. Misura in almeno 60 celle. Altri programmi come ImageJ potrebbe essere utilizzato anche per misurare la distanza, ma Zeiss Luce Zen è preferito a causa della sua maggiore risoluzione dell'immagine e la facilità di zoom avanti e indietro utilizzando tale programma. Immagini in formato LSM aperto nel ImageJ avranno i due canali su uno sopra l'altro. Per fare una foto con entrambi i canali, in primo luogo dividere i due canali e successivamente unirli. Successivamente lo strumento linea può essere usato per misurare le distanze come descritto sopra.
2. Confrontare le distanze medie o medio subcellulare tra ceppi diversi e trattamenti a base di un programma statistico, ad esempio t-test o test di Mann-Whitney della somma dei ranghi, ad esempio utilizzando il SigmaStat-3.5 del software. Spesso i dati non sono distribuiti normalmente poiché ci sarà una selezione per le cellule più brevidistanze tra i segnali fluorescenti in quanto tutti i segnali devono essere sullo stesso piano focale da misurare. Una t-test può essere utilizzato solo quando i dati sono una distribuzione normale, mentre un test Mann-Whitney della somma dei ranghi permette la comparazione di serie di dati che non hanno distribuzione normale. In un t-test la media di due diverse serie di dati vengono confrontati durante una di Mann-Whitney rank test Somma la mediana è confrontato.

5. Rappresentante Risultati

Strain PJ1185: (h his7 ^{+ +::} dis1placR - GFP Chr1 [:: ura4 ⁺ Laco hphMX6] sid4-MRFP:: kanMX6 cut11-mCherry:: natMX6 ura4-D18-32 leu1 ade6-DN / N) è stato coltivato in EMM . Un campione è stato ritirato e montato in una camera di crescita di piccole e le immagini sono state scattate (Fig. 1A + N). Successivamente i mezzi di crescita è stato sostituito con EMM w / o ammoniumchloride (EMM-N), e le cellule sono state grown per 15 minuti agitando. Le cellule affamate di azoto sono state poi montate in una camera di crescita con EMM-N e le immagini sono state scattate (Fig. 1A-N). Lo strumento di misura è stato utilizzato per misurare la distanza tra il luogo (GFP) e l'SPB (Fig. 1B e Tabella 1). Inoltre, la distanza tra il luogo (BPA) e il NM è stato misurato (Fig. 1B e Tabella 2). Le distanze mediana subcellulari prima e dopo l'esaurimento di azoto sono stati confrontati utilizzando il-3.5 SigmaStat software (Tabella 3). C'è stato un cambiamento statisticamente significativo nella localizzazione del cluster gene allontana dalla NM verso la SBP. I dati di misura la distanza tra la GFP e la SBP ha una distribuzione normale e, quindi, le distanze medie (1,777 micron + N e 1.587 micron-N) può essere paragonato con un t-test (Tabella 1 e 3). C'è stata una differenza significativa tra i due valori medi (p = 0.008, t-test). I dati di misura la distanza tra la GFP e NM non ha avuto un normale distribution e quindi le distanze mediana (0 micron + N e 0,390 micron-N) sono stati confrontati con un test Mann-Whitney della somma dei ranghi (Tabella 2 e 3). C'è stata una differenza significativa tra i due valori medi (P <0,001, Mann-Whitney della somma dei ranghi).

Figura 1. La localizzazione di un cluster di geni chiamato Chr1, segnato da GFP, cambiato dopo la morte per fame di azoto. (A) Colonna sinistra, + N, un nucleo cellulare rappresentante di una cellula coltivata in EMM colonna di destra,-N, un nucleo cellulare rappresentante di una cellula coltivata in EMM-N. Il verde è il segnale GFP etichettatura del cluster Chr1, il rosso è il MRFP e mCherry etichettatura SPB e NM, rispettivamente. (B) nucleo della cellula Come (A), ma ora con distanze misurate subnucleare; giallo: il diametro del nucleo della cellula, il blu: la distanza tra SPB e GFP segnale e rosa: la distanza tra il segnale di GFP e la membrana nucleare.

Tabella 1. Le distanze misurate in micron subnucleare del ceppo coltivato in PJ1185 EMM. Prima fila, diametro della cella (d), seconda fila, la distanza tra la GFP e la SPB, terza fila, la distanza tra la GFP e NM.

Tabella 2. Le distanze misurate in micron subnucleare del ceppo coltivato in PJ1185 EMM-N. Prima fila, diametro della cella (d), seconda fila, la distanza tra la GFP e la SPB, terza fila, la distanza tra la GFP e NM.

Tabella 3. Statistiche descrittive delle distanze subnucleare osservata nel ceppo PJ1185 prima (+ N) e dopo (-N) fame di azoto. Prima riga: numero di cellule misurata, seconda fila: diametro medio (d), terzo fila: diametro mediano (d), via riga: distanza media tra la GFP e SPB, quinta fila: distanza mediana tra la GFP e NM.

Discussion

Durante l'ultimo decennio l'uso di immagini di cellule vive di monitorare eventi cellulari è diventato sempre più popolare. E 'iniziato con l'uso della proteina verde fluorescente dalle meduse Aequorea victoria e ora molti fluorocromi differenti sono disponibili a fluorescenza che emette attraverso un ampio spettro di ciano (475 nm) al rosso di gran lunga (648 nm) ^11. Uno dei principali vantaggi di imaging cellulare in diretta su immunofluorescenza è che le cellule non sono fissati da formaldeide o etanolo / acetone trattamento prima di microscopia, quindi evitando manufatti possibile dal processo di fissazione. Inoltre, l'imaging cellulare dal vivo offre la possibilità di seguire le singole cellule e scattare foto ad intervalli frequenti durante le ore o giorni di incubazione, che permette di ottenere filmati di eventi cellulari ^12. Cellule di mammifero hanno il vantaggio di avere una dimensione più grande, con un diametro di circa 100 micron, rispetto alla più piccola cellula di lievito con un diametro di circa 3-4 emu; m. D'altra parte, il vantaggio con il genoma del lievito è facilmente manipolabile. Ricombinazione omologa avviene in modo molto efficiente nel lievito ed è utilizzato per fondere le proteine ​​di interesse a fluorocromi diversi ^3. Inoltre, usando l'integrazione mirata di sequenze Laco e successiva espressione di LacR-proteina GFP permette la rilevazione di una parte specifica del genoma all'interno del nucleo delle cellule ^2. Utilizzando S. pombe cellule in microscopia ha ulteriori vantaggi dal momento che sono naturali organismi unicellulari che crescono con un tempo di generazione veloce in condizioni di cellulari a basso costo cultura. Inoltre, S. pombe è un organismo modello eucariote eccellente poiché ha metazoi geni omologhi.

Uno dei limiti principali di questa tecnica è autofluorescenza nella cellula di lievito disturbare la rilevazione del segnale vero. Questo problema può essere superato utilizzando terreni di coltura minimo con filtro glucosio sterilizzato invece di autoclave. InInoltre le cellule del lievito deve essere coltivate per 2 giorni in fase di log prima di montarli. Il protocollo qui presentata offre un metodo relativamente semplice, ma ancora quantitative per determinare la localizzazione subcellulare delle proteine ​​all'interno della cellula di lievito. Inoltre per scattare foto in diversi momenti siamo in grado di seguire gli eventi cellulari.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente / attrezzature	Azienda	Numero di catalogo	Commento
Lectina	Sigma	L1395
Silicon grasso	Dow Corning
Microscopio a scansione laser LSM 700	Zeiss	LSM 700	Altri microscopio confocale può essere utilizzato.
SigmaStat 3,5	Statcon	SigmaStat 3,5	Qualsiasi software per l'analisi statistica potrebbe essere utilizzato.