Etichettatura cellule staminali con Ferumoxytol, un approvati dalla FDA nanoparticelle di ossido di ferro

Sommario

Abbiamo descritto una tecnica per l'etichettatura e tracciabilità delle cellule staminali con la FDA ha approvato, superparamagnetiche ossido di ferro (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Questa tecnica di imaging cellulare che utilizza la risonanza magnetica (RM) per la visualizzazione, è facilmente accessibile per monitoraggio a lungo termine e la diagnosi di engraftments staminali successo o insuccesso delle cellule nei pazienti.

Abstract

Terapie basate sulle cellule staminali offrono un potenziale significativo per il settore della medicina rigenerativa. Tuttavia, molto resta ancora da capire per quanto riguarda la cinetica in vivo di cellule trapiantate. Un metodo non invasivo per monitorare ripetutamente le cellule staminali trapiantate in vivo avrebbe permesso agli investigatori di monitorare direttamente i trapianti di cellule staminali e di individuare gli esiti attecchimento di successo o insuccesso.

Una vasta gamma di cellule staminali continua ad essere indagato per innumerevoli applicazioni. Questo protocollo si concentra su tre diverse popolazioni di cellule staminali: embrionali umane del rene 293 (HEK293), le cellule, cellule staminali mesenchimali (hMSC) e staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule. HEK 293 cellule derivano da cellule embrionali renali in coltura con tranciati adenovirus 5 del DNA. Queste cellule sono ampiamente utilizzati nella ricerca perché sono facilmente colta, crescono velocemente e sono facilmente transfettate. hMSCs si trovano nel midollo adulti. Queste cellule can essere replicate come cellule indifferenziate, mantenendo multipotenza o la potenzialità di differenziarsi in un numero limitato di destini delle cellule. hMSCs possono differenziare a lignaggi dei tessuti mesenchimali, tra cui gli osteoblasti, adipociti, condrociti, tendini, muscoli e stroma del midollo. le cellule iPS sono geneticamente cellule adulte riprogrammate che sono stati modificati per esprimere geni e fattori simili a definire le proprietà delle cellule staminali embrionali. Queste cellule sono pluripotenti senso che hanno la capacità di differenziarsi in tutte le linee cellulari ^1. Sia hMSCs e le cellule iPS hanno dimostrato la capacità di rigenerazione dei tessuti in vivo.

Risonanza magnetica (RM) con l'uso di etichette superparamagnetiche nanoparticelle di ossido di ferro (SPIO) delle cellule si sono dimostrati efficaci per il monitoraggio in vivo di cellule staminali a causa della risoluzione anatomica microscopica vicino, un sangue più lunga emivita che permette l'imaging longitudinale e la alto sensitivity per il rilevamento delle cellule forniti da RM di SPIO nanoparticelle ^2-4. Inoltre, la RM con l'uso di SPIOs è clinicamente traducibile. SPIOs sono composti da un nucleo di ossido di ferro con uno strato superficiale destrano, carboxydextran o amido che serve per contenere il nocciolo bioreactive ferro da componenti del plasma. Questi agenti creare disomogeneità locali del campo magnetico che portano ad una diminuzione del segnale in immagini T2-pesate RM ^5. Purtroppo, SPIOs non vengono più prodotte. Seconda generazione, ultrasmall SPIOs (USPIO), tuttavia, offrono una valida alternativa. Ferumoxytol (FerahemeTM) è uno USPIO composto da un non-stechiometrico magnetite nucleo circondato da un mantello polyglucose carboxymethylether sorbitolo. Il colloidale, dimensione delle particelle di 17-30 nm ferumoxytol è determinato dal dispersione della luce. Il peso molecolare è di 750 kDa, e il relassività costante a campo 2T MRI è 58,609 MM-1 sec-1 forza ^4. Ferumoxytol è stato recentemente dalla FDA ha approvato uns un integratore di ferro per il trattamento della carenza di ferro nei pazienti con insufficienza renale ^6. Il nostro gruppo ha applicato questo agente in un "off label" l'uso per applicazioni di etichettatura delle cellule. La nostra tecnica dimostra efficace di etichettatura di cellule staminali con ferumoxytol che porta a significativi effetti segnale RM di cellule etichettate sulle immagini MR. Questa tecnica può essere applicata per monitoraggio non invasivo di terapie con cellule staminali in ambito pre-clinico e clinico.

Protocollo

1. Giorno 1

1) Piastra cellule

1. HMSC piastra in un pallone T75 ad una confluenza del 80% almeno 18-24 ore prima dell'etichettatura. Fare riferimento alla Tabella 1 per le istruzioni per le navi alternativo.

2. Giorno 2

2) Preparare la soluzione di etichettatura. Questa preparazione si etichetta un (1) T75 fiasco al 80% confluenza con una concentrazione di 400 mg Fe / ml. Fare riferimento alla Tabella 1 per le istruzioni per le navi alternativo.

1. Creare una soluzione (soluzione 1) mescolando 1 ml di siero-free media e 93,1 l di ferumoxytol (magazzino: 30 mg / ml)....

Discussione

Migliorare l'efficacia di engraftments cellule staminali è fondamentale per il progresso della medicina rigenerativa. Una tecnica non invasiva di visualizzazione per le cellule staminali in vivo migliora in modo significativo la nostra capacità di comprendere i meccanismi che portano a risultati attecchimento di successo. Etichettatura magnetica per la visualizzazione MR, come la procedura abbiamo dimostrato, permette il monitoraggio in vivo di cellule staminali con la RM. Le cellule staminali magn.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
D-MEM glucosio	Sigma	D5648	O medio altra base per la linea di cellule staminali desiderato da utilizzare
D-PBS (Ca + +, Mg + + libero)	GIBCO	14190-144
Tripsina-EDTA 0,05%	Invitrogen	25300-120
Siero fetale bovino (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Ferumoxytol (Feraheme)	AMAG	59338-0775-01
Solfato di protamina	APP Pharm.	22930