Questo è un protocollo per isolare attiva Kinesin piena lunghezza da Drosophila Embrioni per la singola molecola studi biofisici. Mostriamo come raccogliere gli embrioni, fare il lisato embrione, e quindi polimerizzare i microtubuli (MTS). Chinesina è purificato per immobilizzare sul MTS, riducendo la velocità dei Kinesin-MT complessi, e quindi rilasciare il chinesina dalla MTS tramite aggiunta ATP.
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Articolo metodologico
Isolamento e purificazione di chinesina dal Drosophila Embrioni
In questo articolo
Sommario
Abstract
Proteine motrici si muovono carichi lungo i microtubuli, e trasportarli a specifiche sub-cellulari località. Poiché il trasporto alterato viene suggerito alla base di una varietà di malattie neurodegenerative, la comprensione dei microtubuli dei trasporti basata motore e la sua regolamentazione probabilmente in ultima analisi, portare ad un miglioramento degli approcci terapeutici. Kinesina-1 è una proteina eucariotica motore che si muove in una direzione anterogrado (più-end) lungo i microtubuli (MT), alimentato da idrolisi di ATP. Qui riportiamo un protocollo dettagliato di purificazione per isolare attivo chinesina lunghezza intera da embrioni di Drosophila, consentendo così la combinazione di Drosophila genetica con una singola molecola studi biofisici. A partire da circa 50 tazze di posa, con circa 1000 femmine per tazza, abbiamo effettuato le collezioni durante la notte. Questo ha fornito circa 10 ml di embrioni confezionati. Gli embrioni sono stati candeggina dechorionated (producendo circa 9 grammi di embrioni), e quindi omogeneizzato. After interruzione, l'omogenato è stato chiarificato mediante una rotazione a bassa velocità seguita da una centrifugazione ad alta velocità. Il supernatante è stato trattato con chiarito GTP e taxolo a polimerizzare MT. Chinesina è stato immobilizzato su polimerizzato MTs aggiungendo la analogico ATP, 5'-ciclasi imidodiphosphate a temperatura ambiente. Dopo kinesina vincolante, microtubuli sono sedimentate tramite centrifugazione ad alta velocità attraverso un cuscino di saccarosio. Il pellet microtubulo è stata poi ri-sospeso, e questo processo è stato ripetuto. Infine, ATP è stato aggiunto per rilasciare la chinesina dal MT. Centrifugazione ad alta velocità poi centrifugati la MT, lasciando la chinesina nel supernatante. Questo chinesina è stato sottoposto ad una filtrazione centrifuga 100 utilizzando un cut off KD filtro per ulteriore purificazione, frazionare, congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C. SDS gel elettroforesi e western blotting è stato eseguito utilizzando il campione purificato. L'attività motoria dei campioni purificati prima e dopo la fase finale di filtrazione centrifugaè stata valutata utilizzando un saggio in vitro singola molecola microtubuli. Le frazioni chinesina prima e dopo la filtrazione centrifuga mostrato processività come precedentemente riportato in letteratura. Ulteriori esperimenti sono in corso per valutare l'interazione tra chinesina e altre proteine di trasporto correlate.
Protocollo
I ceppi di mosche possono essere acquistati e amplificato in laboratorio. A seconda della quantità di flaconi di coltura di Drosophila ricevuti, una necessità di frequenti 'capovolgere' i flaconi di coltura, una volta che le fiale ha raggiunto la capacità massima. L'amplificazione prosegue fino a circa 50 flaconi di coltura di Drosophila sono riempiti. Si fa poi 'volare coppe' con 100 ml bicchieri tricorno (Fly making cup è discusso nella prossima sezione). Dopo 24 ore, utilizzare gli embrioni da queste tazze di semi nuovi flaconi di coltura di Drosophila con il cibo volare apposta in fondo. A temperatura ambiente, il tempo di crescita per ....
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Discussione
Cervello bovino è il materiale più ampiamente usato per purificare partenza 11 full-length chinesina, sebbene cervello murina è stato usato come pure 12. Un grande svantaggio di utilizzare cervello bovino come fonte chinesina è la disponibilità di fresco materiale di partenza: macelli sono tipicamente inaccessibili, e il cervello deve essere estremamente fresca per ottenere chinesina attivo. Inoltre, solo il cervello dei giovani mucche sono efficaci. Infine, la manipolazione genetica delle vacche n.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Un ringraziamento speciale a Kris Ngai e Jason Del Rio per il loro sostegno e l'assistenza in questo progetto. Questo lavoro è stato supportato da RO1 concessione GM070676 di SPG.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo, o materiale | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Agar (granulato) | Pescatore | 1423-500 | |
| Destrosio (D-glucosio) anidro | Pescatore | D16-3 | |
| Piastre di Petri | Becton | 35 1007 | Style 60x15mm (Poliestere) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorno beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume: 100ml, Dimensioni: 58x72mm |
| Lievito | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesse Scientific | 57-102 | 120 micron dimensione dei pori |
| Nylon Mesh | Parti piccole | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Glicerina | Pescatore | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | |
| MgS0 4 (anidro) | Pescatore | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma | 329-98-6 | |
| Leupeptina | Sigma | 103476-89-7 | |
| AprotOnin | Sigma | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma | 33069-62-4 | |
| ATP analogico 5'-ciclasi imidodiphosphate | Sigma | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma | 74804-12-9 | |
| Amicon Filtri ultracentrifugo: 0,5 mL, 100kD tagliati, 8 confezioni | Millipore | UFC510008 |
Riferimenti
- Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila 2A. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. , Academic Press. 1-81 (1978).
- Roberts, D. B. Drosophila: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1998).
- Kunert, N., Brehm, A.
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Ristampe e permessi
