Determinazione del Raft Lipid partizionamento delle sonde fluorescenti-tag nelle cellule viventi da spettroscopia di fluorescenza di correlazione (FCS)

Sommario

Una tecnica per sondare il partizionamento zattera lipidi di proteine ​​fluorescenti a livello della membrana plasmatica delle cellule viventi è descritto. Si avvale della disparità nei tempi di diffusione delle proteine ​​situati all'interno o all'esterno delle zattere lipidiche. Acquisizione può essere eseguita dinamicamente in condizioni di controllo o dopo l'aggiunta farmaco.

Abstract

Negli ultimi quindici anni l'idea che le membrane cellulari non sono omogenee e si basano su microdomini di esercitare le loro funzioni è stato ampiamente accettato. Raft lipidici sono microdomini di membrana arricchiti di colesterolo e sfingolipidi. Essi giocano un ruolo nella cellulari processi fisiologici quali la segnalazione, e ^1,2 il traffico, ma sono anche pensato di essere protagonisti in diverse malattie tra cui infezioni virali o batteriche e malattie neurodegenerative ^3.

Eppure la loro esistenza è ancora oggetto di controversia ^4,5. Infatti, zattera dimensioni dei lipidi è stata stimata essere di circa 20 nm ^6, ben al di sotto del limite di risoluzione della microscopia convenzionale (circa 200 nm), precludendo così la loro immagine diretta. Fino ad oggi, le principali tecniche utilizzate per valutare la partizione di proteine ​​di interesse all'interno rafts lipidici sono membrane resistente ai detergenti (DRM) isolamento e co-patching con anticorpi. Anche se ampiamente utilizzati Becautilizzo della loro attuazione piuttosto facile, queste tecniche erano inclini a manufatti e quindi criticato ^7,8. I miglioramenti tecnici sono pertanto necessarie per superare questi manufatti e di poter sondare lipidi partizione zattere in cellule viventi.

Presentiamo qui un metodo per l'analisi sensibile di partizione lipidi zattere di proteine ​​fluorescenti-etichetta o lipidi nella membrana plasmatica di cellule viventi. Questo metodo, denominato spettroscopia di fluorescenza di correlazione (FCS), si basa sulla disparità nei tempi di diffusione di sonde fluorescenti situati all'interno o all'esterno delle zattere lipidiche. Infatti, come evidenziato in entrambe le membrane artificiali e colture cellulari, le sonde avrebbero diffondere molto più velocemente fuori che dentro lipid rafts dense ^9,10. Per determinare tempi di diffusione, minute fluttuazioni fluorescenza vengono misurati in funzione del tempo in un volume focale (circa 1 femtoliter), situato a livello della membrana plasmatica di cellule con un microscopio confocale (Fig.1). Le auto-correlazione curve possono quindi trarre da queste fluttuazioni e dotate di adeguati modelli matematici di diffusione ^11.

FCS può essere utilizzato per determinare la zattera lipidica partizionamento di sonde diverse, purché siano fluorescenti tag. Fluorescente etichettatura può essere ottenuto mediante l'espressione di proteine ​​di fusione fluorescenti o dal legame di ligandi fluorescenti. Inoltre, FCS può essere utilizzato non solo nelle membrane artificiali e linee cellulari, ma anche in colture primarie, come descritto di recente ^12. Può anche essere utilizzata per seguire la dinamica di partizionamento lipidi zattera dopo aggiunta farmaco o lipide cambiamento composizione della membrana ^12.

Protocollo

1. Calibrazione del Setup FCS

1. Avviare il microscopio confocale, laser, computer, incubatore per la temperatura e CO ₂ di controllo.
2. Assicurarsi che la SPAD (Single Photon Avalanche Diode) è e che il filtro a fluorescenza all'interno della SPAD ben si adatta al vostro campione. Controllare che la SPAD è sincronizzato nel tempo. Attenzione per avviare solo il software FCS una volta le impostazioni SPAD sono pronti per l'acquisizione.
3. Preparare una soluzione fresca di tossina del colera-Alexa488 diluito in PBS per raggiungere una concentrazione di 1 pg / ml (17,5 nM).
4. Ottimizzazione confocale di soluzione con rilevamen....

Discussione

Il metodo qui presentato FCS permette una analisi sensibile e rapida la compartimentazione lipidi serie di sonde fluorescenti di interesse in cellule viventi. FCS combina l'accuratezza della localizzazione della microscopia confocale con la sensibilità di conteggio di singolo fotone. La differenza principale tra FCS e tecniche standard biochimiche che è FCS permette la determinazione assoluta della partizione lipidi zattere del bersaglio e non la partizione relativo come è il caso per l'isolamento DRM o co-patch.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Subunità B della tossina colerica Alexa-488	Invitrogen	C-34775	MW (pentamero) = 57 kg / mol
Microscopio confocale	Leica	SP5
Incubatore per temperatura e CO 2 di controllo	Vita di imaging servizi	Il cubo e il Box
SPAD (Single Photon Avalanche Diode)	MPD (Micro Photon Devices)	PDM serie (100 micron zona sensibile)
Passa alto 488 nm filtro	Semrock	488 nm blocco bordo Brightline lungo filtro passa Part #ails.aspx? id = "target =" _blank FF01-488/LP-25 "> FF01-488/LP-25
FCS unità di rivelazione	Picoquant	Picoharp 300 Modulo
Acquisizione e di auto-correlazione software	Picoquant	SymPhoTime
Software di fitting	OriginLab	OriginPro8