Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

Summary

In questo articolo si descrivono l'uso di una pinzetta magnetici per studiare l'effetto della forza sulla proteolisi enzimatica a livello di singola molecola in modo altamente parallelizzabile.

Abstract

La generazione e la rilevazione delle forze meccaniche è un aspetto onnipresente della fisiologia cellulare, con rilevanza diretta per metastasi tumorali ^{1, 2} e aterogenesi la guarigione della ferita ^3. In ciascuno di questi esempi, le cellule sia esercitare una forza sul loro ambiente e contemporaneamente enzimaticamente rimodellare la matrice extracellulare (ECM). L'effetto delle forze di ECM è diventata così una zona di notevole interesse per la sua importanza biologica e medica probabile ^4-7.

Tecniche di singola molecola come intrappolamento ottico ^{8, 9} microscopia a forza atomica, e pinzette magnetici ^10,11 consentono ai ricercatori di sondare la funzione di enzimi a livello molecolare esercitando forze su singole proteine. Di queste tecniche, pinzette magnetiche (MT) si distinguono per il loro basso costo ed elevate prestazioni. MT esercitare forze nell'intervallo di 1-100 ~ pN e può fornire risoluzione temporale millisecondo,qualità che sono ben abbinate allo studio del meccanismo enzimatico a singola molecola di livello ^12. Qui riportiamo un saggio MT altamente parallelizzabile per studiare l'effetto della forza sulla proteolisi di singole molecole proteiche. Presentiamo l'esempio specifico della proteolisi di un peptide collagene trimerico da metalloproteinasi della matrice 1 (MMP-1), tuttavia, questa analisi può essere facilmente adattato per studiare altri substrati e proteasi.

Protocol

1. Cella di flusso Preparazione

1. Vetrini coprioggetto (# 1.5, 22x22 mm e 22x40 millimetri, VWR) vengono puliti con ultrasuoni.
   1. Aggiungere i coprioggetti ad un piccolo contenitore di vetro capace di contenere coprioggetto e montaggio nel sonicatore (vedi punto 2).
   2. Riempire il contenitore con isopropanolo e sonicare in un bagno sonicatore per 20 minuti.
   3. Eliminare l'isopropanolo e sciacquare i coprioggetti con abbondanti quantità di acqua deionizzata prodotta da un apparato Barnsted MilliQ o un dispositivo simile. Riempire il contenitore con acqua e ultrasuoni per 20 minuti.
   4. Dopo sonicazione, asciugare i coprioggetti in un flusso di filtrata, priva di polvere nell'aria. Utilizzare solo i coprioggetto che appaiono puliti (cioè senza sbavature).
   5. Delicatamente i coprioggetti fiamma per alcuni secondi per pulirli di eventuali residui di polvere e umidità: passano i coprioggetti attraverso una fiamma del gas prodotto con un becco Bunsen, facendo attenzione a non deformare il coprioggetti a causa del calore in eccesso. Questa fase rimuove superficie residuacontaminanti.
2. Utilizzando del nastro biadesivo scotch, collegare i due coprioggetti insieme. Tagliare il nastro ~ 3 cm di lunghezza e 0,3 cm di larghezza. Fissare il nastro su coprioggetto 22x40 millimetri lasciando un canale di 1,6 cm al centro. Utilizzare un puntale per premere delicatamente verso il basso sul vetrino per garantire che il nastro è correttamente rispettati.

2. Magnetic Tweezers Setup e calibrazione

1. Pinzette magnetiche erano installazione utilizzando permanenti magneti in terre rare come descritto in precedenza ^10,12. Un alluminio L-staffa è stato costruito con un foro 1 mm di diametro e montato su un verticale z traduttore (Thorlabs) per modulare l'altezza delle pinzette. Due permanenti magneti in terre rare sono stati attaccati alla staffa su entrambi i lati del foro per creare la trappola magnetica (Figura 1).
2. Preparazione del DNA: DNA fago lambda marcato al suo 5 'e 3' termina con biotina e digossigenina (IDT DNA, San Diego, CA) è stato usato per calibrare il MAGpinzette magnetiche.
   1. Mescolare 50 pl di 4 nM λ-DNA con 2 pl di 40 nM biotina oligonucleotide coniugato e scaldare a 60 ° C per 10 minuti. Poi, lentamente raffreddare a temperatura ambiente per 1 ora.
   2. Aggiungere DNA ligasi secondo le specifiche del costruttore e legare a temperatura ambiente per 3 ore.
   3. Aggiungere 2 microlitri di 400 nM oligonucleotide digossigenina coniugato ed incubare a temperatura ambiente per 45 minuti.
   4. Aggiungere 1,5 microlitri di 10 mM ATP e continuare ligazione dell'oligonucleotide digossigenina coniugato alla λ-DNA per 3 ore.
   5. Rimuovere gli oligonucleotidi in eccesso e la DNA ligasi con 100 filtri di spin kDa (Microcon Ultracell YM-100). Un totale di 1000 volte scambio tampone in tampone TE è sufficiente a rimuovere i oligonucleotidi eccesso. Nota: è importante non utilizzare velocità di rotazione> 500xG perché porterà al taglio del DNA.
   6. Esaminare un campione di DNA tramite elettroforesi su un gel di agarosio 0,7% per garantire che il DNA is non denaturato o tranciati.
   7. Misurare la concentrazione di DNA. L'uso di un NanoDrop UV-Vis spettrofotometro (Thermo Scientific) è raccomandato poiché il volume del campione disponibile può essere molto piccolo.
3. Preparare celle di flusso come descritto nella sezione 1.
4. Per il fissaggio del DNA alla cella a flusso, aggiungere anticorpo anti-digossigenina (pecora IgG; 1 mg mL ^-1; Bioscience Roche, Mannheim, Germania) e consentono di aderire alla superficie di vetro per 15 minuti.
5. Passivazione della superficie della cella di flusso per prevenire non-specifica incollaggio di DNA aggiungendo 2 mg mL ^-1 BSA, 0,1% Tween-20 in PBS 1x. Incubare a temperatura ambiente per 45 minuti.
6. Ripetere il punto 2.5.
7. Aggiungere 50 pM di fuctionalized λ-DNA e permettono di allegare al vetrino per 15 minuti.
8. Lavare via il DNA in eccesso con PBS 1x.
9. Aggiungere streptavidina-perle rivestite superparamagnetiche (1 perline micron = 2 mg mL ^-1; 2,8 perle um = 20 pg mL ^-1
10. Lavare via perline in eccesso con PBS 1x.
11. Magnetic Tweezers calibrazione
    1. Spostare i magneti permanenti ad una posizione che è lontano dalla superficie del campione (> 15 mm).
    2. Posizionare la cella preparato flusso nel microscopio.
    3. Spostare i magneti permanenti in posizione sopra la cella di flusso.
    4. Scegliere il piano focale di λ-DNA perline funzionalizzati concentrandosi sui talloni da entrambe le superfici di vetro. Il piano focale corretta è quella in cui le perle desiderati hanno un centro luminoso.
    5. Prendete un video del movimento del tallone a 80 Hz o maggiore di 500 frames.
    6. Spostare il magnete vicino alla superficie del campione. Per distanze superiori a 5 mm, si muovono in incrementi di 1 mm. Per distanze comprese tra 1 e 5 mm, si muovono in incrementi di 0,5 mm. Per distanze inferiori a 1 mm, si muovono in incrementi di 0,25 mm.
    7. Ripetere i punti 2.11.5 e 2.11.6 ad ogni nuova posizione del magnete.
    8. Per ciascun datoimpostare, monitorare il centro delle sfere utilizzando una vestibilità 2D gaussiana.
    9. Calcolare la forza tramite le fluttuazioni browniani utilizzando:

    
    dove k _B T è l'energia termica Boltzmann, L è la lunghezza di λ-DNA, e 2> è la varianza in posizione centroide.

    10. Confermare l'accuratezza delle forze controllando il calcolo della forza tramite un fit Lorentzian spettro di potenza al fine di trovare la frequenza attenuazione. Forza applicata è legata alla frequenza di attenuazione dalla relazione:

    
    Dove ₀ ƒ è la frequenza rolloff, a è il raggio tallone, e μ è la viscosità del fluido ^12.

3. Collagene Allegato Peptide alle celle di flusso

Per fornire un esempio concreto per l'applicazione del nostro metodo, si descrive un recente lavoro nostro laboratorio che caratterizza la proteolisi di un peptide trimerico modello collagene. Prevediamo che questo approccio generale può essere diffusamente applicate ad altre proteine ​​e polinucleotidi.

1. Il peptide modello collagene è costituito da un N-terminale 6x His-tag per la purificazione, seguita da un tag 5x myc, (GPP) ₁₀ per applicare formazione tripla elica, il collagene a1 residui 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), che costituiscono la MMP- 1 sito di riconoscimento, la sequenza foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), ed un C-terminale per facilitare KKCK etichettatura con biotina-maleimide. Foldon deriva dal fago T4-fibritin proteina, e stabilizza trimeri modello collagene quando fuse sia nella N - o C-terminale ^13,14.
2. Il peptide collagene e MMP-1 proteine ​​sono state espresse e purificate come descritto in precedenza ^4,15.
3. Aggiungere anti-myc (15 pg ml ^-1) alla cella a flusso e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per consentire l'anti-myc per attaccarsi alla superficie della cella di flusso.
4. Passivazione della cella di flusso per prevenire non-specifica fissaggio di proteine ​​usando 5 mg mL ^-1 BSA allo stesso modo come descritto al punto 2.5.
5. Aggiungere 150 pM peptide di collagene e permettono di allegare l'anticorpo tramite il tag myc per 45 minuti.
6. Lavare via collagene in eccesso con tampone PBS.
7. Aggiungi perle rivestite di streptavidina superparamagnetiche perle (1 micron = 2 mg ml ^-1 e 2,8 perline micron = 20 mg ml ^-1) e consentire loro di attaccare le molecole di collagene per 45 minuti. Le perle di 1 micron deve essere diluito fino alla concentrazione desiderata in PBS. Le perle 3 um deve essere separato dalla soluzione tramite magneti, poi risolubilizzato in PBS. Questo processo deve essere ripetuto 3 volte. Abbiamo notato che questo passaggio è essenziale per la get le 3 perle micron di legarsi alla superficie-peptide immobilizzato collagene.

4. Forza proteolisi Assay

1. Una volta che la cella a flusso è assemblato con il peptide collagene e biglie magnetiche, l'immagine cella di flusso nella trappola magnetica in basso, ~ 1 forza pN. Nella nostra esperienza, una sottopopolazione delle perle è talvolta debolmente aderire alla superficie in un modo non specifico. L'applicazione della forza modesta assicura che queste perle sono liberati.
2. Aggiungere enzima attivato alla cella a flusso. In questo caso MMP-1 è stato pre-attivato con l'aggiunta di 3,5 mM APMA (4-aminophenylmercuric acetato) e incubate a 37 ° C per 3 ore. L'attivazione è stata verificata mediante SDS-PAGE.
3. Appena la cella di flusso viene nuovamente introdotto nell'apparecchio magnetico pinzette, registrare un video estende alcuni campi di vista, tipicamente ottenendo diverse centinaia perline allegate. Questo sarà t = 0.
4. Ripetere lo stesso processo di registrazione di diversi campi di vista (mentre tornava tO lo stesso campo di vista) in punti regolari di tempo, fino a tutte le perline si staccano o non proteolisi più è percepibile.
5. Kinetic analisi dei dati
   1. Contare le perline nei vari campi di vista a tempi diversi e loro media. Normalizza il numero di perle dividendo il numero medio di perline in ogni punto temporale per il numero di perle di t = 0. In questo modo siamo in grado di confrontare i tassi di proteolisi da diversi esperimenti, perché il numero assoluto di perline sarà diverso da esperimento esperimento.
   2. Tracciare il rapporto in funzione del tempo. In questo caso, abbiamo montato un decadimento esponenziale più una costante.

   
   dove ƒ (t) è il rapporto delle perline allegate (o molecole di collagene unproteolyzed), t è il tempo, a è la frazione di sfere collegate da una ritenuta collagene, b è il tasso costante di decadimento, ecè la frazione di perle che sono attaccate in modo non specifico.

   3. Lo stesso esperimento viene ripetuto a varie forze e MMP-1 concentrazioni di chiarire l'effetto della forza sulla proteolisi collagene di MMP-1.

5. Risultati rappresentativi

Il protocollo sopra descrive un nuovo uso di pinzette magnetico (Figura 1) per studiare l'effetto della forza sulla proteolisi enzimatica. Abbiamo calibrato le pinzette di 1 um e 3 perline micron utilizzando sia l'ampiezza delle fluttuazioni osservati browniani e calcolo del roll-off frequenza diverse posizioni magneti (Figura 2). In esperimenti di proteolisi delle forze, la configurazione è simile tranne che il DNA viene sostituito con collagene (figure 3, 4). Il numero normalizzato di perline rimanenti possono essere tracciate in funzione del tempo per trovare le tariffe proteolisi (Figura 5), e questo processo può essereripetuto per diverse concentrazioni degli enzimi e forze.

Figura 1. Schematica del processo di calibrazione magnetico trappola (non in scala). Due magneti permanenti terre rare creare un campo magnetico che tira sulla superparamagnetico tallone. Tradurre il magnete su e giù regola la forza applicata. Le perle vengono esposte con un convenzionale in campo chiaro microscopio con la luce che passa attraverso un forellino fra i due magneti Inset:. Immagine ripresa con un obiettivo 40x aria. I taglienti, macchie rotonde corrispondono ai talloni attaccati alla superficie coverslip. Gli out-of-focus oggetti sono perle indipendenti.

Figura 2. Grafici della forza calibrata in funzione della distanza dal magnete superficie del campione di 1 micron (sinistra) e 2,8 micron (a destra) di tallones. I dati sono stati adatti alla funzione empirica , Dove x è la distanza dal magnete. A = 31,8, b = 5,61, e c = 4,39 per le perle 1 um e uno = 140, b = 3,10 e c = 1,86 per le perle 3 micron. Questi valori sono specifici per il nostro strumento specifico e geometria sperimentale, e ciascuno strumento deve essere calibrato individualmente. Le barre di errore in ciascun punto rappresenta una variabilità ~ 10% in forza applicata su una base di tallone tallone, a causa della variabilità di dimensioni del tallone. La forza applicata è proporzionale al volume delle perline, e il volume tallone varia ~ 9% rispetto alla media (secondo le specifiche del costruttore).

Figura 3. Forza test di setup proteolisi (non in scala). Il modello trimero collagene è attaccato alla superficie del vetrino via mYC / anti-myc coniugazione. Le perle rivestite con streptavidina superparamagnetici sono attaccati alle trimeri collagene tramite un legame di biotina-streptavidina. Attivato MMP-1 tagli il collagene nel tempo, causando le perline a staccarsi dalla superficie e si allontana dal piano focale.

Figura 4. Cartone schematica di proteolisi in funzione del tempo. La vignetta mostra un campo di campione di vista nel corso del tempo, come accade proteolisi. Nel tempo, MMP-1 tagli il collagene e le perline staccare e allontanarsi dal piano focale sotto l'influenza del campo magnetico.

Tassi di proteolisi Figura 5. Dipendono forza applicata ^16. Vengono mostrati i dati raccolti a 1,0 pN (3 uM MMP-1, nero), 6,2 pN (3 uM MMP-1, rosso) e 13 pN (0,2 uM MMP-1; magoNTA). I tassi di proteolisi parametri (fit) sono: 0,22 ± 0,02 min ^-1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 min ^-1 (6,2 PN), e 2,08 ± 0,18 min ^-1 (13 PN). La frazione di perle unproteolyzed a tempi lunghi (> 15 minuti) resta pressoché costante a ~ 0,25 in diversi esperimenti. Le barre di errore corrispondono alle statistiche Poisson che riflette il numero di osservazioni in ogni punto. L'errore ad ogni tempo di perline n n è ^1/2. L'errore nella frazione di perline attaccate è stato calcolato errore propagation.1 perle um sono stati utilizzati per pN 1,0 e 6,2 esperimenti pN e 2,8 um perline sono state usate per gli esperimenti pN 13.

Discussion

Questo protocollo descrive un nuovo uso per una tecnica classica singola molecola. Pinzette magnetiche consentono medio high-throughput saggi singola molecola in un modo economicamente efficiente. Tuttavia, come tutte le tecniche sperimentali ci sono sfide e le insidie ​​potenziali.

Limitazioni di pinzette magnetiche

Rispetto ad una trappola ottica la risoluzione spaziale e temporale di un apparato MT è bassa. Inoltre, le forze generate dal MT semplice qui descritte...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
Micro copertura in vetro # 1.5 (22x22)	VWR	48366-067
Micro copertura in vetro # 1.5 (22x40)	VWR	48393-048
Lambda DNA	Invitrogen	25250-010
DNA ligasi T4	Invitrogen	15224-041
Microcon Ultracel YM-100	Millipore	42413
Anti-digossigenina	Roche Diagnostics	11-333-089-001
Tween 20	Sigma	P9416-100ML
Anticorpo anti-myc	Invitrogen	46-0603
Albumina di siero bovino	Sigma	B4287-5G
Dynabeads M-280 streptavidina	Invitrogen	658.01D
Dynabeads MyOne T1 Streptavidina	Invitrogen	658.01D
p-acetato Aminophenylmercuric	Calbiochem	164610
Biotina-maleimmide	Sigma Aldrich	B1267
Marcate con biotina oligo	IDT DNA	Sintesi personalizzata
Digossigenina marcato oligo	IDT DNA	Sintesi personalizzata
Collagenegene del peptide	DNA 2,0	Sintesi personalizzata
MMP-1 cDNA	Harvard Database plasmide
z-traduttore	Thorlabs	MTS50
Servo regolatore di traduttore	Thorlabs	TDC001