Noi descriviamo un protocollo per l'utilizzo di proteine morfogenetiche dell'osso-7 (BMP-7) o Matrigel per indurre selettivamente la crescita dendritica in primarie neuroni simpatici dissociate dai gangli cervicale superiore (SCG) di ratti perinatali.
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Articolo metodologico
Indurre crescita dendritica in colture di neuroni simpatici
In questo articolo
Sommario
Abstract
La forma del dendritico pergolato determina l'ingresso totale sinaptica un neurone può ricevere 1-3, e influenza i tipi e la distribuzione di questi ingressi 4-6. Modelli alterati di crescita dendritica e plasticità sono associate con una compromissione della funzione neuro-comportamentale in modelli sperimentali 7, e si pensa di contribuire a sintomi clinici osservati in entrambi i 8-10 disturbi dello sviluppo neurologico e malattie neurodegenerative 11-13. Queste osservazioni sottolineano l'importanza funzionale di regolare con precisione la morfologia dendritica, e suggeriscono che l'individuazione di meccanismi che controllano la crescita dendritica non solo promuovere la comprensione di come è regolata la connettività neuronale durante lo sviluppo normale, ma possono anche fornire indicazioni sulle nuove strategie terapeutiche per diverse patologie neurologiche.
Studi meccanicistici di crescita dendritica sarebbe molto facilitato dalla disponibilità ofa modello di sistema che permette ai neuroni di essere sperimentalmente passa da uno stato in cui non si estendono ai dendriti quello in cui elaborare un pergolato dendritico paragonabile a quella del loro controparti in vivo. Colture primarie di neuroni simpatici dissociate dai gangli cervicale superiore (SCG) di roditori perinatali fornire tale modello. Quando coltivate in mezzo definito in assenza di cellule gliali e siero gangliare, neuroni simpatici estendere un unico processo che è assonale, e questo stato unipolare persiste per settimane a mesi in coltura 14,15. Tuttavia, l'aggiunta di una proteina morfogenetica ossea-7 (BMP-7) 16,17 o Matrigel 18 al mezzo di coltura innesca questi neuroni di estendere i processi multipli che soddisfano i criteri morfologici, biochimici e funzionali di dendriti. Neuroni simpatici dissociati dal SCG di roditori perinatali e coltivate in condizioni definite sono una popolazione omogenea di 19 neuroniche rispondono in modo uniforme al dendrite-promuovere l'attività di Matrigel, BMP-7 e BMP altri decapentaplegic (DPP) e 60A sottofamiglie 17,18,20,21. È importante, Matrigel e BMP-indotta la formazione di dendrite si verifica in assenza di variazioni nella sopravvivenza cellulare o crescita assonale 17,18.
Qui, descriviamo come impostare dissociate culture di neuroni simpatici derivati dalla SCG di ratti perinatali in modo che siano rispondenti alle selettivo dendrite-promuovere attività di Matrigel o BMP.
Protocollo
1. Preparazione del terreno di coltura (media C2)
- Aggiungere la seguente, nell'ordine elencato, ad una sterile, monouso beuta da 500 ml Erlenmeyer:
Quantità Componente Concentrazione finale 190 ml DMEM (glucosio basso) N / A 10 ml acidi grassi liberi BSA (20mg/ml in DMEM) 50 ug / ml 2,8 ml L-Glutammina 1,4 mm 4 ml insulina / transferrina / selenio (100x) 10 pg / ml di insulina 5,5 ug / ml di tran....
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Discussione
I vantaggi di questo modello includono: (a) le colture sono costituiti da una popolazione omogenea di neuroni simpatici privi di altri tipi di cellule 17,23, (b) i requisiti per il fattore di crescita di neuroni simpatici sono ben stabiliti, che consente di utilizzare mezzo definito, e una varietà di supporti definiti, e substrati funzionano bene per la crescita e mantenimento neuroni simpatici 23, (c) neuroni in queste colture rispondono uniformemente alla dendrite-attività di promozione di Matrig.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Institutes of Health (borse NS45037 R21 e R01 ES014901).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Vetrini coprioggetto | Bellco | 1943-10012 | 12 Turno Coverslip mm # 1 Spessore, vetro tedesco |
| Bent punta di pipette | Bellco | 1273-50003 | |
| Poly-D-lisina | Sigma | P0899-100mg | Soluzione stock 1 mg / ml |
| Acqua distillata | Gibco | 15230 | |
| Belle pinza Dumont no. 4 e 5 | Strumenti Scienza Belle (FST) | 11252-30 11241-30 | |
| 20-gauge aghi | Becton Dickinson | 305176 | |
| Leibovitz L-15 | Invitrogen | 11415 | |
| Collagenasi | Worthington | 4176 | 1 mg / ml |
| Dispasi | Roche | 04942078001 | 5 mg / ml |
| Sale di Hank soluzione equilibrata (-Ca, Mg-) | Invitrogen | 14185-052 | |
| DMEM glucosio basso | Invitrogen | 11885 | |
| L-Glutammina | Invitrogen | 25030 | 20 mM |
| Insulina / transferrina / Selenium | Invitrogen | 51500-056 | 100X |
| Di acidi grassi liberi BSA | Calbiochem | 126609 | |
| NGF | Harlan Bioproducts | 5017 | |
| Ham F-12 medio nutrienti (F-12) | Invitrogen | 11765 | |
| Citosina arabinoside | Sigma | C1768 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Evitare ripetuti cicli gelo-disgelo |
| BMP-7 | R & D Systems Curis, Inc. | 345-BP BMP7-07H | BMP 4, 5 e 6 funzionare altrettanto bene come BMP-7 e sono talvolta più facile da ottenere commercialmente |
| Paraformaldeide | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Pescatore | BP151-500 | |
| Topo anti-ratto MAP2 anticorpo | Sternberg monoclonali Inc. | SMI52 | 1/5000 |
| Alexa Fluor 546 di capra anti-topo | Invitrogen | A11003 | 1/10000 |
| Mezzi di montaggio | Prolungare Probes kit molecolare Antifade | P7481 |
Riferimenti
- Purpura, D. P. The Neurosciences: A Study Program. Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. , Rockefeller University Press. 372-393 (1967).
- Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252....
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Ristampe e permessi
