Dimostriamo come sezionare e cultura pulcino ganglio statoacoustic E4 ed E6 espianti midollo spinale. Espianti sono coltivate sotto siero senza condizioni in gel di collagene 3D per 24 ore. Reattività dei neuriti è testato con fattore di crescita integrata medie e con le proteine rivestite perline.
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Articolo metodologico
Dissezione e Cultura della gangliari Chick Statoacoustic Espianti e del midollo spinale in gel di collagene per saggi crescita dei neuriti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli organi sensoriali dell'orecchio interno di pollo sono innervate dai processi periferici del ganglio statoacoustic (SAG) neuroni. Innervazione organo sensoriale dipende da una combinazione di segnali guida degli assoni 1 e fattori di sopravvivenza 2 situata lungo la traiettoria degli assoni in crescita e / o all'interno degli stessi obiettivi degli organi sensoriali. Per esempio, l'interferenza funzionale con un percorso classico di guida degli assoni segnalazione, semaforina-Neuropilin, generato misrouting di assoni otic 3. Inoltre, diversi fattori di crescita espresse negli obiettivi sensoriali dell'orecchio interno, compresi neurotrofina-3 (NT-3) e del fattore neurotrofico cervello derivato (BDNF), sono stati manipolati in animali transgenici, ancora una volta porta a misrouting di assoni SAG 4. Queste stesse molecole promuovere sia la sopravvivenza e la crescita dei neuriti dei neuroni SAG pulcino in vitro 5,6.
Qui, descriviamo e dimostrare il metodo in vitro stiamo ucantare per testare la reattività dei neuriti SAG pulcino alle proteine solubili, tra cui morfogeni noto come il Wnts, così come fattori di crescita che sono importanti per la promozione dei neuriti escrescenza SAG e la sopravvivenza dei neuroni. Usando questo sistema modello, speriamo di trarre conclusioni circa gli effetti che ligandi secreto può esercitare sulla sopravvivenza dei neuroni e SAG crescita dei neuriti.
Espianti SAG sono sezionato il giorno embrionale 4 (E4) e coltivate in gel tridimensionale di collagene sotto siero senza condizioni per 24 ore. In primo luogo, la reattività dei neuriti è testato da espianti coltura integrata con proteine di media. Poi, per chiedere se fonti puntuali di ligandi secreto può avere effetti direzionali sulla crescita dei neuriti, gli espianti sono co-coltura con le proteine rivestite perline e analizzati per la capacità del cordone di promuovere a livello locale o inibire escrescenza. Abbiamo anche una dimostrazione della dissezione (modificato protocollo 7) e la cultura della E6 espianti midollo spinale. Noiabitualmente uso espianti midollo spinale per confermare bioattività delle proteine e proteine-impregnati perline, e per verificare le specie reattività crociata con i tessuti pulcino, alle condizioni stessa cultura espianti SAG. Questi test in vitro sono utili per lo screening rapido per le molecole che esercitano trofico (sopravvivenza) o tropico (direzionale) effetti sui neuroni SAG, soprattutto prima di effettuare studi in vivo. Inoltre, questo metodo permette la sperimentazione di singole molecole sotto siero senza condizioni, con alta sopravvivenza dei neuroni 8.
Protocollo
Ricette
Chick Ringers
| 7,2 g | NaCl |
| 0,23 g | CaCl 2 + 2H 2 O |
| 0,37 g | KCl |
| 0,115 g | Na 2 HPO 4 |
| 900 ml | Acqua (cultura grado Tissue) |
Nota: Regolare il pH a 7,4. Portare il volume finale a 1000 ml con acqua.
PBS 10X
| 40 g | NaCl |
| 1 g | KCl |
| 7 g | Na 2 HPO 4 |
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Discussione
Vi presentiamo un metodo per sezionare e cultura SAG E4 ed E6 espianti midollo spinale, da ragazza, sotto siero senza condizioni. Questa procedura è attualmente utilizzato nel nostro laboratorio per studiare gli effetti dei vari ligandi secreto SAG sulla sopravvivenza dei neuroni e crescita dei neuriti. Nuovi aspetti di questo protocollo includono l'uso di un siero privo di espianti di sistema per la coltura e l'uso di perline imbevute di fattori di crescita per studiare gli effetti sulla escrescenza SAG neuriti.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health di Grant RO1DC002756 e la Purdue Research Foundation. Ringraziamo Wu Doris e Wiese Chang per la consulenza con esperimenti e McPhail Rodney aiuto con figure.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commento |
| Attrezzatura | |||
| Dissezione microscopio | Usiamo un stereomicroscopio Leica M80 con campo chiaro di base di illuminazione | ||
| Far scorrere più caldi | CS & E. | Collagene polimerizzazione | |
| Pollo uovo incubatore | |||
| 37 ° C / 5% CO 2 umidificata coltura cellulare incubatore | |||
| Dissezione Materiali | |||
| Sylgard &copia; rivestito capsula di Petri | |||
| 24-oltre piastra di coltura cellulare | Corning | 3526 | |
| # 5 Dumont forcipe | Strumenti Scienza multa | 11252-30 | |
| # 55 Dumont forcipe | Strumenti Scienza multa | 11295-51 | |
| Perni in acciaio inox dissezione | Strumenti Scienza multa | 26002-10 | Embrione pinning, dissezione multa |
| Moria mestolo forato | Strumenti Scienza multa | 10370-17 | Embrione raccolta / trasferimento |
| 200 ul larga bocca pipetta suggerimenti | Dot Scientific Inc | 118-96R | Espianto trasferimento |
| E4 e uova di gallina E6 | & Nbsp; | ||
| Soluzione pulcino Ringer | Embrione vendemmia | ||
| HBSS | Sigma | H8264 | SAG dissezione |
| L15 media | Sigma | L5520 | Midollo spinale medio dissezione |
| Siero di vitello fetale | Atlanta Biologicals | S11150 | Midollo spinale medio dissezione |
| Vännäs Forbici | Mondo Strumenti di precisione | 501778 | Dissezione del midollo spinale |
| Collagene preparazione | |||
| Rat-tail collagene di tipo I | BD Biosciences | 354249 | Espianto cultura |
| 10X PBS (sterili) | Per neutralize collagene | ||
| NaOH 1N (sterili) | Per neutralizzare collagene | ||
| Acqua distillata (sterile) | Per neutralizzare collagene | ||
| pH carte indicatore (6,0-8,1) | Whatman | 2629-990 | Per controllare il pH collagene |
| Provette da 15 ml | Dot Scientific Inc | 818-PG | |
| 500 microlitri larga bocca pipetta suggerimenti | Dot Scientific Inc | 119-R100 | Al collagene pipetta |
| Espianto cultura | |||
| DMEM/F12 media | Sigma | D8437 | Espianto terreno di coltura |
| IL SUO 1 | Sigma | I2521 | Supplemento media |
| Penicillina-Streptomicina | Invitrogen | 15140-122 | Supplemento media |
| CNTF (ratto) | Sigma | C3835 | Supplemento media |
| NT-3 (umano) | Sigma | N1905 | Supplemento media |
| Purificato del mouse Wnt5a | R & D Systems | 645-WN-010 | |
| Affi-gel blu gel perline | Bio-Rad | 153-7302 | |
| Immunoistochimica | |||
| Paraformaldeide | Sigma | P6148 | Fissazione |
| PBS | Risciacqui | ||
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Soluzione bloccante |
| Sodioazide | Sigma | S8032 | Soluzione bloccante |
| Siero di vitello | Invitrogen | 16170-078 | Soluzione bloccante |
| Monoclonale IgG2b anti-tubulina β 1 + II anticorpi | Sigma | T8535 | Corpi cellulari etichette e neuriti |
| Alexa fluor 488 capra anti-topo IgG2 anticorpi b | Invitrogen | A21141 | Rileva anticorpi β tubulina |
| Micro teflon spatola | VWR | 57949-033 | Gel di collagene rilascio da ben |
Riferimenti
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).
- Fritzsch, B. Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia.....
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Ristampe e permessi
