$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
La cellula eucariotica si basa su complessi, altamente regolamentato, e compartimenti di membrana funzionalmente distinti associati, che conservano una polarità biochimica necessaria per una corretta funzione cellulare. Capire come gli enzimi, proteine, e componenti del citoscheletro governare e mantenere questa separazione biochimica è quindi di fondamentale importanza. L'utilizzo di molecole fluorescenti tag di localizzare e / o turbano compartimenti subcellulari ha prodotto un patrimonio di conoscenze e avanzato la nostra comprensione della regolazione cellulare. Tecniche di imaging come la microscopia confocale a fluorescenza e rendere esaminano la posizione di una molecola fluorescente etichettato piccola relativamente semplice, tuttavia la risoluzione di strutture molto piccole è limitato 1.
D'altra parte, microscopia elettronica ha rivelato i dettagli di morfologia subcellulare ad altissima risoluzione, ma la sua natura statica rende difficile misurare pro altamente dinamicoprocessi con precisione 2,3. Pertanto, la combinazione di microscopio ottico con il microscopio elettronico dello stesso campione, chiamato Luce correlativa e Microscopia Elettronica (CLEM) 4,5, offre il duplice vantaggio di imaging fluorescente con ultraveloce ad alta risoluzione della microscopia elettronica 6. Questa potente tecnica è stata implementata per studiare molti aspetti della biologia cellulare 5,7. Fin dalla sua nascita, questa procedura ha aumentato la nostra capacità di distinguere architetture subcellulari e morfologie ad alta risoluzione.
Qui, presentiamo un metodo semplificato per eseguire microiniezione rapida seguita da CLEM (Fig. 1). La procedura CLEM microiniezione può essere utilizzato per introdurre quantità specifiche di piccole molecole e / o proteine direttamente nel citoplasma delle cellule eucariotiche e studiare gli effetti di millimetro a multi-nanometri risoluzione (Fig. 2). La tecnica si basa sul microinjectingcellule coltivate su vetrini con laser a griglia applicata sul fondo dei piatti cellule vive e immagini sia con la microscopia confocale a fluorescenza ed elettronica. Localizzazione della cella (s) di interesse è facilitata dalla griglia, che viene facilmente trasferita, insieme con le cellule di interesse, alla resina Epon utilizzato per l'immobilizzazione di campioni e sezionamento prima analisi microscopia elettronica (Fig. 3). Sovrapposizione di immagini fluorescenti e EM permette all'utente di determinare la localizzazione subcellulare nonché eventuali cambiamenti morfologici e / o ultrastrutturali indotte dalla molecola microiniezione di interesse (Fig. 4). Questa tecnica è suscettibile di punti di tempo variabili da ≤ 5 s fino a diverse ore, a seconda della natura del campione microiniezione.