Topi transgenici sono stati estremamente utili per attribuire funzione fisiologica ai geni. Come tale, la ricerca in generale, e studi funzionali delle vie aeree, in particolare, hanno subito un notevole spostamento verso modelli murini. Qui forniamo protocolli per In vitro Studi di costrizione trachea per valutare la funzionalità della muscolatura liscia delle vie aeree in murino.
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Articolo metodologico
Nelle misure in vitro di costrizione tracheale con Mice
In questo articolo
Sommario
Abstract
Transgenici e topi knockout sono potenti strumenti per lo studio della fisiologia e fisiopatologia delle vie aeree 1,2. In tensometry isolati in vitro di preparazioni tracheali ha dimostrato di essere un saggio utile della muscolatura liscia delle vie aeree (ASM) risposta contrattile nei topi geneticamente modificati. Questi preparati in vitro tracheali sono relativamente semplici, forniscono una risposta forte, e trattenere sia funzionali terminazioni nervose colinergiche e risposte muscolari, anche dopo lunghi incubazioni.
Tensometry tracheale fornisce inoltre un saggio funzionale per studiare una varietà di vie di segnalazione secondo messaggero che influenzano la contrazione della muscolatura liscia. Contrazione della trachea è mediato principalmente dai parasimpatici, nervi colinergici che rilasciano acetilcolina sulla ASM (Figura 1). I principali recettori muscarinici dell'acetilcolina ASM sono M2 e M3 che sono G e I / O GQ recettori accoppiati, rispettivamente 3,6,7. M2 / G i / o segnalazione è creduto per migliorare contrazioni mediante inibizione di adenilato ciclasi che porta ad una diminuzione dei livelli di cAMP 5,8,9,10. Questi percorsi costituiscono il cosiddetto "farmaco-contrazione" della muscolatura liscia delle vie aeree 11. Inoltre, colinergici segnalazione attraverso i recettori M2 e M3 modulata dal segnale) comporta percorsi che depolarizzare il ASM che a loro volta attivano L-type, voltaggio-dipendenti canali del calcio (Figura 1) e flusso di calcio (cosiddetto "eccitazione-contrazione" ) 4,7. Recensioni più dettagliate sulle vie di segnalazione che controllano costrizione delle vie respiratorie può essere trovato 4,12. Le vie di cui sopra sembrano essere conservati tra i topi e altre specie. Tuttavia, trachee topo differiscono da altre specie in alcuni percorsi di segnalazione. Il più importante è la loro mancanza di risposta contrattile di istamina e adenosina 13,14, entrambi i modulatori ASM ben noti negli esseri umani e altre specie 5,15.
Presentiamo qui protocolli per l'isolamento di murini anelli tracheali e la misura in vitro della loro produzione contrattile. Sono incluse le descrizioni della configurazione delle apparecchiature, l'isolamento anello di trachea e misure contrattili. Esempi sono forniti per evocare contrazioni indirettamente con elevata stimolazione dei nervi e potassio direttamente da depolarizzazione del muscolo ASM attivare il voltaggio-dipendenti influsso di calcio (1. Alto K +, Figura 1). Inoltre, i metodi sono presentati per stimolazioni di nervi solo utilizzando stimolazione di campo elettrico (2. EFS, Figura 1) stimolazione, o per diretta del muscolo ASM utilizzando neurotrasmettitore esogeno applicato alla vasca (3. Esogeno ACH, Figura 1). Questo FLExibility e facilità di preparazione rende il modello di anello trachea isolata un saggio robusto e funzionale per un numero di segnalazione cascate coinvolti nella contrazione muscolare liscia delle vie aeree.
Protocollo
1. Attrezzatura
I componenti principali di un dispositivo di misurazione contrazione sono mostrate schematicamente in figura 2A).
- Un bagno tessuto. Il bagno tessuto mantiene una soluzione ossigenata fisiologica a temperatura calda. Per topi anelli trachea, si usa un bagno tessuto 10 ml contenente una camicia d'acqua per la circolazione di una soluzione di riscaldamento, un ingresso di vetro sinterizzato a bolle di ossigeno (95% / 5% O 2 / CO 2 miscela) e di ingresso e di uscita per cambiare soluzioni. Una soluzione PSS serbatoio viene memorizzato a ebollizione costante....
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Discussione
Il protocollo qui presentato fornisce una preparazione fisiologica per valutare la funzionalità muscolare delle vie aeree. In genere funzionano 3-4 prodotti per il bagno di organi contemporaneamente, tuttavia, i sistemi preconfezionati sono disponibili un certo numero di fornitori che permettono misurazioni simultanee fino a 8 preparazioni (ADInstruments, strumenti di precisione del mondo, e apparecchi di Harvard). Abbiamo utilizzato un certo numero di trasduttori di forza e bagni organo tessuto con risultati equivalent.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione da parte del Centro per l'Innovazione nella prevenzione e nel trattamento delle malattie delle vie aeree, NINDS sovvenzione (NS052574), e dal Programma per la Ricerca Sandler asma.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reattivo | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Convertitore analogico-digitale | ADInstruments | PowerLab 4/35 | |
| Carbacolo (Chloride Carbamoylcholine) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10 -2 M in acqua (aliquote possono essere conservati a -20 ° C) |
| Charting Software | ADInstrtuments | LabChart | |
| Riscaldamento circolatore | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Trasduttore di forza isometrica | Kent Scientific | TRN001 | |
| Stimolatore | Grass Technologies | S88 Squ Doppia uscitasono Pulse stimolatore | |
| Carta igienica | WPI | 47264 |
Riferimenti
- Lloyd, C. M. Building better mouse models of asthma. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 231-236 (2007).
- Hausding, M., Sauer, K., Maxeiner, J. H., Finotto, S. Transgenic models in allergic responses. Curr. Drug Targets. 9, 503-510 (2008).
- Eglen, R. M., Hegde, S. S., Watson, N.
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Ristampe e permessi
Tag
Misurazione della forza isometricaisolamento degli anelli trachealistimolazione del campo elettricostimolazione ad alto contenuto di potassioattivazione dei recettori colinergicimuscolo liscio delle vie aereepreparazione della trachea di topocalibrazione del bagno per tessuticonfigurazione del trasduttore di forza
