Il saggio neuroblasti: un test per la generazione e arricchimento delle cellule progenitrici neuronali di differenziare i Progeny cellule staminali neurali in citometria a flusso

Sommario

Questo protocollo video viene illustrato un nuovo metodo per la generazione e la successiva purificazione delle cellule progenitrici neuronali da una fonte rinnovabile di cellule staminali neuronali (NSC) sulla base della loro fisico (granularità e dimensione interna) e proprietà di fluorescenza usando citometria di flusso tecnologia.

Abstract

Le cellule staminali neuronali (NSC) possono essere isolate ed espanse in larga scala, utilizzando il saggio neurosfere e differenziato in tre tipi principali di cellule del sistema nervoso centrale (CNS); vale a dire, astrociti, oligodendrociti e neuroni. Queste caratteristiche rendono staminali neurali e cellule progenitrici una preziosa fonte rinnovabile di cellule per studi in vitro, come lo screening di stupefacenti, neurotossicologia ed elettrofisiologia ed anche per la terapia di sostituzione cellulare in molte malattie neurologiche. In pratica, tuttavia, l'eterogeneità della progenie NSC, bassa produzione di neuroni e oligodendrociti, e il predominio di astrociti seguenti differenziazione limitare le loro applicazioni cliniche. Qui, descriviamo una metodologia innovativa per la purificazione e la successiva generazione dei neuroni immaturi di topo nati da NSC con fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS), la tecnologia. Usando questa metodologia, altamente arricchito neuronale popolazione di cellule progenitrici può essere realizzato spiritoHout qualsiasi astrociti evidente e bona fide contaminazione NSC. La procedura prevede differenziazione di progenie NSC isolate ed espanse da E14 eminenze gangliari topo con il test neurosfere, seguito da isolamento e arricchimento delle cellule neuronali immature base alle loro proprietà fisiche (dimensioni e complessità interna) e fluorescente citometria di flusso tecnologia. Nel complesso, ci vogliono 5-7 giorni per generare neurosfere e 6-8 giorni per differenziare progenie NSC altamente purificato e isolare cellule neuronali immature.

Protocollo

1. Impostazione di base prima di procedere alla coltura cellulare

1. NeuroCult Media NSC basale e NeuroCult NSC supplementi proliferazione vengono miscelati con un rapporto 9:1, rispettivamente, per rendere completo supporto NSC.
2. A 37 ° C bagno di acqua viene utilizzata per riscaldare il mezzo.
3. Giusta quantità di calore inattivato siero fetale bovino (FCS) è stato scongelato.
4. Quantità appropriata di soluzioni crescita fotografici fattore compreso il fattore di crescita epidermico (EGF a 10 pg / ml), fattore di crescita fibroblastico (FGF-B a 10 pg / ml) e 0,2% soluzione di eparina in salina tamponata con fosfato (PBS) vengono scongelate.
5. Fiaschi coltura tissutale (T25, T75 e T175 o) sono necessari per l'espansione e la differenziazione NSC.
6. Colture di tessuti trattati 96 e 24 pozzetti e vetrini sono necessari per la placcatura cellule ordinati.

2. Isolamento ed espansione (Passaging) di NSCs

1. Staminali neurali e cellule progenitrici sono isolate ed espanse da mouse bpioggia come descritto in protocolli separati ^{1, 2 3.}
2. Quando il neurosfere (neurosfere sia primarie o diversi passaggi) sono pronti per subcoltura (150-200 micron di diametro), le sfere terreno contenente viene trasferita ad un tubo di tessuto appropriato sterile cultura dimensioni, e centrifugate a 800 rpm (110 g) per 5 min a temperatura ambiente.
3. Il mezzo supernatante viene rimosso e le sfere vengono risospese in 1 ml di pre-riscaldato 0,05% tripsina-EDTA.
4. Dopo incubazione a 37 ° bagnomaria C per 2-3 min, un volume uguale di inibitore della tripsina di soia viene aggiunta alla sospensione cellulare per interrompere l'attività tripsina.
5. Per assicurare che la tripsina è stato completamente inattivato, la sospensione cellulare viene delicatamente pipettano su e giù 3-5 volte.
6. Dopo centrifugazione a 800 rpm (110 g) per 5 minuti, il surnatante viene rimosso e le cellule vengono risospese in 1 ml di mezzo completo NSC.
7. 10 pl di sospensione cellulare viene miscelata con 90 pl di trypan blu per eseguire un numero di celle.
   Nota: Altri diluizioni cellulari idonee possono anche essere utilizzati.
   
8. Le cellule vengono poi usati per subcultura ^{1, 2} o per differenziazione come descritto di seguito.

3. Differenziazione delle staminali neurali e cellule progenitrici, il saggio neuroblasti (NBA)

1. Le cellule risultanti da neurosfere dissociate sono piastrate ad una concentrazione di 2-3 x 10 ⁵ cellule / ml in mezzo completo NSC supplementato con 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF, 1 pl / ml di eparina 0,2% e il 5% FCS inattivato al calore in un pallone di coltura tissutale appropriate dimensioni. 5 ml di mezzo è utilizzato per T25, T75 per 20 ml e 40 ml per T175 palloni.
   Nota: FCS causerà le cellule per fissare saldamente al substrato e non è necessario per il rivestimento dei cilindri per la cultura NBA.
   
2. Cultoure beute vengono poi incubate a 37 ° C incubatore umidificato con 5% CO ₂ per 3-4 giorni. Questo periodo viene chiamata fase di proliferazione, durante la quale progenie NSC collegare al substrato e proliferare come un monostrato di cellule.
3. Quando la coltura diventa 90-95% confluenti, il mezzo di ciascun pallone viene commutato al mezzo completo NSC supplementato con 5% FCS in assenza di fattori di crescita.
4. Beute di coltura sono nuovamente incubate a 37 ° C incubatore umidificato con 5% CO ₂ per altri 3-4 giorni. Questo periodo è chiamato stadio di differenziazione, durante la quale progenitori neuronali appaiono in cima ad un monostrato astrociti proliferano e per rendere colonie di cellule neuronali immature. Il giorno 4-5 della fase di differenziazione, la coltura è pronta per l'isolamento delle cellule neuroblasti citometria di flusso tecnologia.

4. Preparazione celle per citometria a flusso

Trypsinizazione

1. La cultura di differenziare progenie NSC giorno 4-5 della fase di differenziazione viene lavata una volta con una quantità appropriata di PBS (2 ml per T25, T75 per 4 ml e 8 ml per T175 pallone) per rimuovere FCS dalla coltura.
   Nota: FCS blocchi tripsina-EDTA attività.
   
2. Poi, una quantità sufficiente di pre-riscaldato 0,05% tripsina-EDTA (2 ml per T25, T75 per 4 ml e 8 ml per T175 pallone) viene aggiunto a ciascun pallone a coprire il monostrato di cellule e incubate per 1-2 min in uno 37 ° C incubatore umidificato.
3. Il pallone viene controllato al microscopio per valutare l'effetto di Tripsina-EDTA sulla cultura. Il pallone viene tenuto con una mano e colpito saldamente con l'altra mano per rimuovere le cellule dal fondo del pallone.
4. Volume uguale di inibitore di tripsina di soia viene aggiunta al pallone per estinguere attività tripsina. La sospensione cellulare viene delicatamente pipettano su e giù da garantire l'inattivazione tripsina e per realizzare una cella singola omogeneasospensione.
   Nota: In alternativa, media supplementato con 5% FCS potrebbe essere utilizzata per estinguere attività tripsina.
   
5. Per rimuovere non dissociati ciuffi, la sospensione cellulare viene fatto passare attraverso un 40-pm di dimensione filtro a maglie.
6. La sospensione cellulare viene quindi centrifugata a 800 rpm (110g) per 5 minuti, il surnatante viene rimosso e le cellule vengono risospese in un volume adeguato di mezzo completo NSC.
7. Il volume finale della sospensione cellulare è regolata in modo che la densità cellulare non supera 2-3x10 ⁶ -cells/ml. Ad alta densità cellulare potrebbe causare il blocco flusso nella macchina citometria a flusso.
8. Se si desidera isolare le cellule neuronali solo in base alle loro proprietà fisiche, ora si può procedere alla FACS smistamento come descritto nella parte 4.
9. Prima di smistamento, ioduro di propidio (PI, Sigma, 500 mg / ml in PBS) è aggiunto ad una concentrazione di 1 pl / ml di sospensione cellulare per escludere cellule morte.

Vivi cell immunomarcatura

Per ottenere una purezza più elevata di cellule neuronali, raccolte singola cellula dalla cultura NBA può essere colorato per PSA-NCAM (un indicatore dei primi progenitori neuronali immature) e poi le cellule positive da parte della popolazione neuronale può essere isolato utilizzando la macchina FACS.

1. Dopo aver eseguito un conteggio delle cellule, la sospensione singola cellula dalla cultura NBA è diviso in quattro gruppi:
   • Le cellule di gruppo, serve solo come controllo per regolare i parametri e cancelli (0,5-1 x 10 ⁶ celle).
   • Cellule più PI, serve come controllo per regolare i parametri e cancelli (0,5-10 x 10 ⁶ celle). Cellule PI negativi di questo gruppo possono essere ordinati in base alle caratteristiche fisiche cellule.
   • Secondario solo (Isotype gruppo di controllo) che serve anche come controllo per regolare i parametri e cancelli (1-2 x 10 ⁶ cellule).
   • Immunomarcatura gruppo (8-10 x 10 ⁶ cellule) che si è macchiato per PSA-NCAM per raggiungereulteriore purificazione delle cellule neuronali immature. Per escludere le cellule morte su ordinamento, PI viene aggiunto a questo gruppo pure.
2. Per avviare immunomarcatura, le cellule vengono centrifugate a 800 rpm (110 g) per 5 min. Il supernatante viene rimosso e le cellule vengono risospese in 100 pl di mezzo completo NSC.
3. Ficoeritrina (PE) coniugato anti-PSA-NCAM anticorpo viene aggiunto ad un rapporto di 10 microlitri / 5-10 x 10 ⁶ cellule alla sospensione cellulare per essere colorati per PSA-NCAM. Allo stesso modo, un PE coniugato anticorpo IgG1 controllo isotipico viene aggiunto alla sospensione cellulare isotipo di controllo. Seguire le istruzioni sul foglio delle specifiche di anticorpi quanto riguarda la concentrazione di anticorpi da utilizzare. La sospensione cellulare viene quindi miscelata delicatamente e incubate a temperatura ambiente per 10-15 minuti in scuro.
4. Le sospensioni cellulari (PSA-NCAM e tubi controllo isotipico) vengono quindi centrifugati a 800 rpm (110 g) per 5 minuti, il surnatante viene rimosso e le cellule sono ri-suspended in 1 ml di mezzo completo NSC.
5. Per rimuovere l'eccesso non-limitati anticorpi dai campioni, 4 step è ripetuto 2-3 volte.
6. Dopo re-sospensione cellule in un volume adeguato di mezzo, ioduro di propidio (PI, Sigma, 500 mg / ml in PBS) è aggiunto ad una concentrazione di 1 pl / ml delle sospensioni di cellule (cellule più PI, isotipo di controllo e PSA- NCAM macchiate campioni) per escludere cellule morte quando analizzate mediante citometria di flusso.
7. 15 ml provette sterili falcon contenenti 1 ml di terreno completo sono pronti a raccogliere le cellule ordinati provenienti da diverse popolazioni cellulari.

5. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) di neuroni immaturi

1. La macchina FACS è impostato in base al suo manuale d'istruzioni tramite il tecnico esperto di citometria a flusso struttura.
2. Soluzione salina tamponata (PBS) o qualsiasi altra soluzione appropriata depending su istruzioni del produttore, potrebbe essere utilizzato come fluido di guaina a 28 PSI mediante un ugello 90 micron.
3. Pressione differenziale sul sistema sia regolato in modo che il tasso di innesco tipo non superi i 2500 eventi al secondo.
4. La sospensione cellulare dalle cellule gruppo solo viene eseguito attraverso la macchina FACS.
5. In primo luogo, le cellule (eventi) vengono riportati in base alla loro dimensione (Forward Scatter (FSC), luce) rispetto complessità interna (Side Scatter (SSC), luce) per distinguere diverse popolazioni cellulari. Per fare ciò, i parametri di tensione per FSC e SSC deve essere regolato in modo che le cellule possono essere visti nella trama citometria a flusso.
6. Per escludere ciuffi e farsetti cellule, le cellule vengono prima tracciate sulla base dell'area dispersione in avanti (FSC-A) rispetto a larghezza d'impulso scatter avanti (FSC-W) e la popolazione singola cellula è controllato come popolazione 1 (P1). Quindi le cellule P1 sono riportati sulla base di zona laterale scatter (SSC-A) rispetto scatter ampiezza di lato impulso (FSC-W) e questa volta le singole cellule sono gated in quanto popolazione 2 (P2). Avendo stabilito questi due porte consecutive, grumi o doppietti (FSC di alta larghezza di impulso e di alta SSC larghezza d'impulso) sono stati esclusi.
7. Per escludere le cellule morte o danneggiate, le singole cellule (P2) sono tracciate sulla base di reattività rispetto PI FSC-A e la popolazione singola cellula dal vivo è recintato.
8. Singole cellule vive sono riportati sulla base di FSC rispetto SSC per distinguere diverse popolazioni cellulari in base alle dimensioni delle cellule e la granularità interna. In questa fase due popolazioni cellulari principali sono gated come FSC ^basso SSC ^bassa (P3) e FSC ^elevata SSC ^alta (P4) popolazioni cellulari.
9. Per ordinare PSA-NCAM cellule immature immuno-reattivi neuronali dalla ^bassa popolazione FSC SSC ^basso, il primo FSC popolazione ^{a basso} SSC ^basso da cellule di controllo (oltre a PI e isotipo di controllo) i gruppi è tracciata sulla base di immunoreattività PE rispetto FSC-A e il negativo cellule sono gated (P5), e poi le cellule positive da PSA-NCAMgruppo macchiato sono gated come popolazione 6 (P6).
10. Dopo aver regolato tutte le porte necessarie, le cellule di interesse vengono ordinati in 15 tubi di tessuto ml sterili contenenti 1 ml di coltura media NSC.
11. Ordinati cellule vengono quindi centrifugate a 1200 rpm (240 g) per 5 min.
12. Il supernatante viene scartato ed il pellet viene risospeso in un volume adeguato di mezzo (a seconda della dimensione pellet) e un conteggio delle cellule viene effettuato.
13. Le cellule vengono quindi piastrate in Poly-L-ornitina rivestite piastre da 96 pozzetti ad una densità di 20-30 x 10 ³ cellule / pozzetto in 200-250 microlitri di terreno completo NSC con 5% FCS e 20 ng / ml umana ricombinante BMP4 ⁵ .

Nota: a mantello 96 pozzetti, 100 pl di soluzione di poli-L-ornitina lavoro (1,5 ml Poly-O e 8,5 ml di PBS sterile) viene aggiunto a ciascun pozzetto e la piastra viene incubata a 37 ° C incubatore per almeno un ore. Quindi, il Poly-O viene rimosso e ciascun pozzetto viene lavato tre volte con PBS sterile(Lasciare il PBS rimanere nel bene per 10 minuti ogni volta). Usare 500 pl di Poly-L-ornitina lavoro soluzione / se ben 24-pozzetti vengono utilizzati.

14. Le cellule vengono poi fissati a tempi diversi dopo ditta utilizzando freddo paraformaldeide al 4% e immunomacchiate appropriati marcatori di cellule neuronali e gliali per valutare il fenotipo di cellule selezionate provenienti da diverse popolazioni cellulari.

6. Risultati rappresentativi

Nella cultura neuroblasti differenziazione saggio (NBA), cellule placcati collegare al substrato coltura tissutale e crescere come monostrato. A seconda della densità iniziale placcatura delle cellule, la cultura si trasformerà in una cultura del 90-95% confluenti dopo 3-4 giorni. In questa fase, un monostrato di cellule principalmente astrocitari possono essere visualizzate sotto con piccole cellule progenitrici neuronali rotonde sopra ^4,5 (Figura 1). Dopo il passaggio del mezzo su un supporto fattore di crescita libera, le cellule progenitrici neuronali iniziaredividono rapidamente e generare gruppi di cellule immature neuroblasti sopra del monostrato astrociti in 4-5 giorni (Figura 2). Analisi di citometria di flusso del dissociato cultura NBA il giorno 4-5 stadio di differenziazione, mostra due principali popolazioni cellulari; FSC SSC ^{bassa bassa} e FSC ^{di alta} SSC ^alto in base alle dimensioni delle cellule (FSC) e la granularità interna (SSC) (Figura 3). Immuno-fluorescente analisi delle celle ordinate indica che le cellule neuronali sono situate principalmente nelle ^basse FSC popolazioni SSC ^basso (con più del 75% della loro espressione β-tubulina III), mentre cellule selezionate dalla popolazione FSC ^alta SSC ^alta sono prevalentemente astrociti GFAP immunoreattive (Figura 4). Ulteriore purificazione delle cellule neuronali immature fino a quasi omogeneità (97%) potrebbe essere raggiunto con la selezione positiva del PSA-NCAM cellule IR da parte della popolazione FSC ^bassa SSC ^basso (Figura3, 4). Arricchito cellule neuronali generati dalle NSCs isolati da topo E14 eminenze gangliari acquisire un fenotipo GABAergico ed esprimere DARPP-32, un marker di neuroni spinosi medi, sulla differenziazione (Figura 5).

Figura 1. Test cultura neuroblasti dalla E14 cellule staminali neuronali di topo il giorno 4 della fase di proliferazione. Questa cultura monostrato costituito da celle piatte astrocitari (punte di freccia) sotto e rotonde cellule progenitrici neuronali (frecce) sulla parte superiore. Original ingrandimento; 20 x.

. Figura 2 test cultura neuroblasti dalla E14 cellule staminali neuronali di topo il giorno 4 dello stadio di differenziazione: A) contrasto di fase, B) colorazione immunofluorescenza. Si noti il cluster di cellule neuronali immature (frecce in A e β tubulina III colorazione in B) sulla parte superiore del monostrato astrociti (punte di freccia in A, colorazione GFAP in B). Original ingrandimento; 20 x.

. Figura 3 appezzamenti di ordinamento rappresentativi: A). FSC vs SSC sorta plot prima esclusione di doppiette e cellule morte. B, C). Appezzamenti di ordinamento per l'esclusione di doppietti a base di FSC e SSC larghezza d'impulso. D). Esclusione delle cellule morte e danneggiate sulla base di immunoreattività ioduro di propidio. E). FSC vs SSC complotto dopo l'esclusione di doppietti e cellule morte, che mostra i due principali popolazioni etichettati come la ^bassa FSC SSC ^bassa e gli ^alti FSC popolazioni SSC ^elevate. F, G). Appezzamenti Ordina per isolare PSA-NCAM cellule immature IR dal FSC di ^popolazione SSC ^basso.

Micrografie rappresentativi Figura 4. A partire da cellule ordinati da diverse popolazioni un giorno dopo la placcatura. A) FSC ^bassa popolazione SSC ^bassa (più del 75% di queste cellule sono i neuroni). B) FSC ^di popolazione SSC ^alto (la maggior parte di queste cellule sono astrociti ). C) PSA-NCAM ⁺ cellule ordinati dalla popolazione FSC SSC ^{bassa bassa} (quasi tutte le celle sono ordinati neuroni). Ingrandimento originale, 20 x.

Figura 5. Ordinati neuroni immaturi differenziarsi in neuroni GABAergici (A) ed espressi DARPP-32 (B), un marker per medie neuroni spinosi.

Discussione

La capacità di isolare definite popolazioni di cellule nervose (neuroni cioè, astrociti e oligodendrociti) potrebbe risolvere alcuni degli impedimenti connessi con l'applicazione clinica delle cellule staminali neurali (NSC). In primo luogo, ci permette di caratterizzare completamente la popolazione di partenza di cellule del donatore. In secondo luogo, permette di utilizzare un particolare tipo di cellula o una combinazione di tipi di cellule diversi con un rapporto specifico, a seconda della natura o stadio della ...

Materiali

Nome del reattivo	Tipo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
NeuroCult NSC medio basale	Medio	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC proliferazione Integratori	Supplemento media	Stem Cell Technologies	05701
0,05% di tripsina-EDTA	Reagente	Gibco	25300-062
Inibitore della tripsina di soia	Reagente	Sigma	T6522
Pen / Strep	Reagente	Gibco	15140-122
* MEM	Reagente	Gibco	41500-018	HEM componente
* I HEPES	Reagente	Sigma	H4034	HEM componente
* Acqua distillata	Reagente	Gibco	15230-147
Cella filtro	Setaccio	BD Falcon	352340
T25 pallone	Cultura ware	Nalge Nunc internazionale	136196
T80 pallone	Cultura ware	Nalge Nunc internazionale	178905
15 ml provette	Cultura ware	BD Falcon	352096
50 ml provette	Cultura ware	BD Falcon	352070
EGF	Fattore di crescita	R & D	2028-EG
b-FGF	Fattore di crescita	R & D	3139-FB
Eparina	Fattore di crescita	Sigma	H4784	Ricostituita in PBS
Anti-PSA-NCAM-PE	Anticorpo	Miltenyi Biotec	130-093-274
PE-coniugata del mouse IgG1	Isotype controllo dell'anticorpo	BD Pharminogen	556029
Eparina	Fattore di crescita	Sigma	H4784	Ricostituita in PBS
HrBMP-4	Fattore di crescita	R & D	314-BP-010
Poly-L-OrnitHine	Reagente	Sigma	P4957
Di siero di vitello fetale	Supplemento media	Gibco	10099-141
GFAP	Anticorpo	DAKO	Z0334
B-III tubulina	Anticorpo	Promega	G7121

* Per fare HEM, mix 1 x 10 L pacchetto di MEM e 160 ml di HEPES 1M e portare il volume a 8,75 L con acqua distillata. Impostare il pH finale di 7,4 e conservarlo a 4 ° C.